MicroRNA-138-5p靶向KLF11抑制小鼠海馬組織神經炎癥

崔媛 宋鴻濤 張培 尹霄 王瑩 魏萱

目前，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者的數目逐年遞增[1,2]。大量研究證據表明，DM都會引起中樞神經系統病變，即為糖尿病認知功能障礙(diabetes-associated cognitive decline,DACA)，嚴重者甚至會發展成為癡呆，并且認為DM是導致DACA的獨立危險因素[3]。DACA的發病機制較為復雜，包括氧化應激、神經炎癥、Aβ沉積、神經營養缺乏、血腦屏障破壞等，然其具體機制尚待闡明。因此，明確DACA的病變機制已經成為科研和臨床關注的首要任務。研究發現，在T2DM認知障礙患者血清中的炎性因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、白介素-1(interleukin-1β,IL-1β)水平均明顯高于不存在認知功能障礙的糖尿病患者[4],并且有實驗證實IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子有促進β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積的作用，影響認知功能[5]。亦有報道發現，炎性因子可上調β-分泌酶(β-site APP cleaving enzymes,BACE)的水平，導致淀粉樣蛋白前體(amyloid protein precursor,APP)增多，加速Aβ的沉積[6]。在糖尿病合并阿爾茨海默病的大鼠模型中，糖基化終產物的受體(receptor of AGE,RAGE)的上調使中樞血管炎性反應加重，從而損害認知功能[7]，可見神經炎性反應在DACA的發生發展過程中發揮重要的作用。microRNAs (miR)是一類小分子非編碼RNA，在各種炎性疾病的過程中發揮重要的調節作用[8]。已有證明，人類大腦中富集的miRNAs存在發育階段特異性、組織特異性和細胞特異性的表達特征，并在神經系統的發育和認知過程中發揮關鍵作用[9]。最近，多項證據表明miRNAs參與了亨廷頓舞蹈病、神經管缺陷和阿爾茨海默病等多種疾病的發生[10]。基于全基因組轉錄測序，Gibbons等[11]證明了miRNAs和lncRNAs是精神分裂癥發病過程中的重要貢獻者。另外，有研究證明miR-155-5p通過正反饋調節激活NF-κB通路誘導小膠質細胞的炎性反應，進而引發神經炎性病變，影響認知功能[12]，但是miRNAs在DACA中的作用及分子機制尚不明確。同時，我們前期工作提示，姜黃素具有改善糖尿病小鼠認知障礙的功能[4-6]。本研究擬探討測序中的候選miR-138-5p作為研究對象，明確其在糖尿病認知功能障礙小鼠神經炎性中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Curcumin (MCE公 司，HY-N0005)； 鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma 公司)；TNF-α、 IL-1β抗體(Proteintech公司)，miR-138-5p mimics，miR-138-5p inhibitor脂質體(上海吉瑪公司)。

1.2 DM小鼠模型建立 8周雄性C57BL/6J小鼠40只，體重(20～25) g，隨機分為正常對照組(n=10)、模型組(n=15)、Curcumin治療組(n=15)3組。除正常對照組外，均采用高脂喂養4周，空腹12 h 后，腹腔注射STZ 60 mg/kg，繼續高脂喂養2周，定期測小鼠血糖和體重，接連兩周檢測小鼠血糖>11.1 mmol/L[8]及小鼠出現葡萄糖耐量異常[9]時，證明DM模型建立成功。然后Curcumin治療組連續給藥2周/d。給藥期間，全部小鼠常規飼料飼養。

1.3 微陣列分析 提取4～8 μg海馬組織的miRNA富集RNA用于miRNA微陣列，應用MiRNA微陣列技術分析不同基因型間的差異表達miRNAs。

1.4 細胞的培養 BV-2細胞在含10%胎牛血清(FBS)的α-MEM完全培養基中，置 37℃、5%CO2的培養箱中生長，每2～3天傳代1次，所有實驗所用細胞均取處于對數生長期的細胞。

1.5 細胞轉染 實驗分為以下4組(1)miR-138-5p組，加入miR-138-5p mimics和脂質體。(2) miR-138-5p inhibitor組,加入miR-138-5p inhibitor和脂質體。(3)NC對照組，加入NC 100 nmo1/L和脂質體。(4)空白對照組，無任何轉染。以2×105/孔接種于6孔板，37℃、5%CO2培養過夜；轉染前2 h，收集六孔板細胞， 加入無血清 1640 培養基；轉染步驟：①用 250 μl無血清 opti-MEM 分別稀釋 RNA(按照說明書用 DEPC 水配置成 20 μmol/L溶液)。②使用前輕輕混勻LipofectamineTM2000，然后取8 μl的LipofectamineTM2000 稀釋在 opti-MEM 中，室溫下靜置5 min。③室溫下靜置5 min后，混合 LipofectamineTM 2000 和 RNA 的稀 釋液(總體積為 500 μl)。每個培養孔加入混合液 500 μl混勻。

1.6 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 取收集處理后的細胞，加入1 ml TRIzol試劑及200 μl氯仿提取總RNA，Nanodrop 定量儀檢測RNA的濃度和純度。按照Invitrogen qRT-PCR的M-mlV第一鏈合成系統說明書制備cDNA。以U6為內參在ABI7500 Fast 中進行擴增以檢測各組miR-138-5p和TNF-α、 IL-1β mRNA的表達水平。擴增引物由上海生工公司合成。反應條件：50℃預處理2 min，循環1次；95℃預變性10 min，循環1次；95℃變性15 s，循環40次；60℃退火30 s，循環40次；72℃延伸30 s，循環40次。各組均設3個復孔。以2-ΔΔCt法表示各目的基因的相對表達量。見表1。

表1 引物序列

1.7 Western Blot檢測 收集細胞，加入RIPA細胞裂解液提取細胞蛋白。BCA法測定細胞總蛋白濃度。各孔取30 μg蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離(濃縮膠90 V電壓，30 min；分離膠120 V電壓，90 min)。將分離后的蛋白電轉移(200 mA電流35 min)至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入兔抗人KLF5和鼠抗人β-actin單克隆抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)4℃反應過夜。次日先以TBST洗膜5次，每次10 min。后加入HRP標記的鼠抗兔或兔抗鼠IgG(體積稀釋比例為1∶20 000)，室溫反應1 h。再用TBST洗膜5次，每次10 min。按ECL試劑盒說明進行顯影。

1.8 雙熒光素酶報告實驗 在24孔培養板中接種細胞，將重組的野生型或突變型載體和miRNA共轉染細胞，放置在CO2培養箱中培養24 h后，檢測熒光素信號。

1.9 統計學分析 應用GraphPad 8.0軟件進行單因素方差分析比較各組差異。

2 結果

2.1 DACA和正常對照組小鼠海馬組織中miRNA芯片表達 差異表達譜的比較結果顯示DACA和正常對照組小鼠海馬組織中18個miRNA顯著變化，其中13個miRNAs顯著上調(P<0.05)，5個miRNAs顯著下調(P<0.05)，其中miR-138-5p降低最為顯著(Fold change值=-1.28)。見表2。

表2 對照組和模型組小鼠海馬中的 miRNAs差異表達分析

2.2 DACA和正常對照組小鼠海馬組織中miRNA和TNF-α和IL-1β的表達 為了驗證芯片分析的準確性，挑選變化最顯著的7個miRNAs，進行qRT-PCR分別進行結果驗證。qRT-PCR的結果顯示，表達水平miR-355-3p、miR-200b-5p、miR-31a-3p和miR-146a-3p在DACA模型組中表達上調，miR-138-5p、miR-181b-5p和miR-653-3p表達下調，表明驗證的miRNAs的變化與芯片結果一致。同時檢測到TNF-α和IL-1β在DACA組中的mRNA表達水平顯著高于正常對照組(t=6.102,3.648,P<0.05)，考慮到miR-138-5p的表達在DACA模型組小鼠海馬組織中表達明顯減少，接下來，我們選擇miR-138-5p作為靶定miRNA，研究其在DACA中的作用及分子機制。見表3、4。

表3 小鼠海馬miRNA表達譜的變化

表4 對照組和模型組小鼠海馬TNF-α和IL-1β的mRNA的表達變化

2.3 miR-138-5p的作用靶點 使用miRNA靶點預測網站TargetScan網站預測miR-138-5p的作用靶點，結果顯示KLF11與miR-138-5p之間存在潛在的相互作用。KLF11 mRNA (pMir-KLF11 3’UTR-WT)和突變KLF11 3’UTR的mRNA (pMir- KLF11 3’UTR-MUT),采用熒光素酶報告基因方法檢測。將pMir-KLF11 3’UTR-WT和pMir-KLF11 3’UTR-MUT與miR-138-5p mimic或NC mimic(模擬陰性對照)共轉染到293T細胞中。雙熒光素酶素報告基因結果顯示miR-138-5p mimic和pMir-KLF11 3’UTR-WT共轉染組熒光素酶活性顯著低于NC mimic和pMir-KLF11 3’UTR-WT的熒光素酶活性(t=5.00,P<0.01)。然而，miR-138-5p mimic和pMir- KLF11 3’UTR-MUT共轉染組沒有顯著性差異熒光素酶活性的變化(t=0.50,P=0.64)。說明miR-138-5p 可以通過結合其3’UTR直接調控KLF11的表達。見圖1，表5。

圖1 miR-138-5p與KLF11 3’UTR中的結合位點

表5 熒光酶素報告基因檢測miR-138-5p與KLF11的作用

2.4 轉染miR-138-5p mimic后BV-2細胞中LPS誘導的促炎TNF-α、IL-1β因子的mRNA和蛋白水平變化情況 轉染miR-138-5p mimic抑制了BV-2細胞中LPS誘導的促炎TNF-α、IL-1β因子的mRNA和蛋白水平。qRT-PCR結果顯示，與對照組LPS+NC相比，LPS+miR-138-5p mimic組中TNF-α、IL-1β因子的mRNA顯著降低(P<0.01)，western blot結果顯示與對照組LPS+NC相比，LPS+miR-138-5p mimic組中上述促炎因子蛋白水平也顯著降低(P<0.05)，說明miR-138-5p mimic可以抑制LPS誘導的促炎因子的表達。見表6，圖2。

表6 熒光定量PCR技術檢測miR-138-5p mimic轉染后TNF-α和IL-1β的mRNA的表達變化

圖2 Western blot技術檢測miR-138-5p mimic/inhibitor轉染后TNF-α和IL-1β的蛋白的表達變化

2.5 轉染miR-138-5p inhibitor后BV-2細胞中LPS誘導的促炎TNF-α、IL-1β因子的mRNA和蛋白水平變化情況 轉染miR-138-5p inhibtor促進了BV-2細胞中LPS誘導的促炎TNF-α、IL-1β因子的mRNA和蛋白水平。qRT-PCR結果顯示，與對照組LPS+NC相比，miR-138-5p inhibtor組中TNF-α、IL-1β因子的mRNA顯著增加(P<0.001)，western blot結果顯示與對照組LPS+NC相比，miR-138-5p inhibtor組中上述促炎因子蛋白水平也顯著升高(P<0.01)，說明miR-138-5p inhibtor可以促進LPS誘導的促炎因子的表達。見表7。

表7 熒光定量PCR技術檢測miR-138-5p inhibitor轉染后TNF-α和IL-1β的mRNA的表達變化

3 討論

本研究評估了miR-138-5p在糖尿病小鼠海馬神經炎癥和認知損傷中的作用，證實了miR-138-5p在小鼠海馬中的表達顯著降低，首次證明了miR-138-5p在神經炎癥和認知功能損傷中的作用。

研究證明神經炎癥與認知障礙有關，在糖尿病合認知障礙中尤為重要。臨床前調查顯示，海馬神經炎癥導致記憶功能障礙的原因如下：(1)海馬區與記憶任務[13]有關;(2)海馬神經炎癥水平高低與海馬神經記憶功能障礙嚴重程度相關[14,15];(3)海馬神經炎癥導致長期的腦電位中斷[16,17]。近年來，有研究證明腫瘤壞死因子-α在海馬體中炎癥和認知能力下降的過程中發揮重要作用。例如，TNF-α介導的信號通路在神經炎癥中的作用會導致老年大鼠認知功能障礙，并伴有促炎細胞因子，包括TNF-α， IL-1β， IL-6的顯著升高，而在腦內R-7050,TNF-α受體拮抗劑，其通過抑制下游NF-κB和MAPK信號通路的激活途徑，以導致上述促炎細胞因子的減少，進而改善老年大鼠認知功能下降[18]。此外，TNF-α也發揮神經調節作用功能，特別是在調節小膠質細胞和星形膠質細胞大腦的激活[19]。例如，TNF-α通過誘導IL-6的釋放，促進BV-2小膠質細胞的活化[20]。Terrando等[21]證明TNF-α作用于上游IL-1β，并啟動外周細胞因子級聯反應導致認知能力下降。

MiRNA是微小RNA分子，約由19～25個核苷酸組成，屬于非編碼RNA，miRNA主要與轉錄后的mRNA相結合來調控細胞代謝活動。一個miRNA可以與數百個mRNA結合，使mRNA降解或抑制其翻譯過程，來影響基因的表達和代謝通路作用。miRNA結合的mRNA一般通過以下步驟被沉默：(1)結合后使mRNA鏈斷裂；(2)破壞其多聚A尾端結構使mRNA穩定性下降，易被降解；(3)使mRNA翻譯的效率降低[22,23]。miRNA已被發現參與了多種疾病的病理生理機制，包括腫瘤、過敏性疾病、心血管疾病、神經退行性疾病等。例如，在阿爾茨海默病(AD)中，在AD患者的海馬和額葉內側回中發現miR-125b表達顯著上調[24]。 此外，在人類原代星形膠質細胞中，miR-125b也被證明能抑制表達干擾素調節因子4(IRF4)與補體因子-H蛋白(CFH)，參與促炎癥反應的因子反應[25]。此外miR-146a也被報道可以通過負反饋調節人星形膠質細胞介導的炎癥反應[26]。現如今miRNA已成為新的潛在的生物標記物的研究方向。一個理想的生物標記物必須是特異性的，高度敏感的，并且可以定量，以非侵入性檢查最佳，還要求成本低并且操作簡單。然而，miRNAs在糖尿病誘導海馬神經炎癥中的作用和認知能力的作用還未明確，為了進一步明確miR-138-5p在DACA中的作用及分子機制，使用miRNA靶點預測網站TargetScan網站預測miR-138-5p的作用靶點，結果顯示miR-138-5p可以結合KLF11的3’UTR。

細胞生長抑制蛋白Kruppel樣因子11(KLF11)，也稱為轉化生長因子-β-誘導型早期基因2(TIEG2)，是Sp1/KLF鋅指轉錄因子家族的成員之一，參與調控葡萄糖的攝取與代謝、脂質代謝、胰島素分泌等一系列代謝相關基因的表達。體外實驗學結果顯示KLF11蛋白在額葉皮質和海馬中的表達顯著增加，但在紋狀體和下丘腦中未檢測到KLF11表達的顯著變化，表明KLF11蛋白表達受慢性應激的選擇性影響，而糖尿病誘發的認知功能障礙正是高血糖的慢性刺激對海馬組織誘導的炎性病變[27]。除此之外，有研究者發現 KLF11 同樣參與了神經細胞分化過程，并在高度分化的人星形膠質細胞中與P300 相互作用，上調多巴胺 D2 受體活性，影響到精神分裂癥、帕金森氏病等疾病的發生發展過程[28],并且研究表明KLF11還是A型單胺氧化酶的轉錄激活因子，KLF11可以通過SP1結合位點增加腦A型單胺氧化酶的表達，KLF11過表達進而增加A型單胺氧化酶基因表達和酶活性；而由si-RNA介導的KLF11敲除能降低A型單胺氧化酶基因表達和酶活性，并在與應激相關的抑郁障礙中發揮重要作用[29]。綜上，KLF11 作為一個廣泛表達的轉錄因子，其下游靶分子眾多，在不同的組織器官中發揮著不同的生物學功能。

本研究的局限性在于，明確了miR-138-5p在糖尿病誘導海馬神經炎癥中的作用和認知能力的作用，以及對KLF11的結合作用，對于KLF11是否有直接的調控作用是下一步的研究重點，目前的研究是一個試點研究，另外將包括miR-138-5p對糖尿病認知功能障礙小鼠的治療的應用以及對小鼠海馬神經炎癥與認知行為改變的體內研究部分也是需要進一步研究的內容。