circ_0041795靶向miR-361-3p對高糖誘導的人腎小管上皮細胞損傷的影響

柳越 王巖 高艷超 魏冰

糖尿病腎病(DN)是主要的糖尿病微血管疾病之一，可影響糖尿病患者的長期生存率，更是終末期腎臟疾病的主要原因[1]。腎小管細胞損傷是DN的主要特征之一，研究認為高血糖通過多種機制促進活性氧產生，加重氧化應激反應，誘導腎小管上皮細胞凋亡增加，從而導致腎小管損傷[2]。因此，尋找有效抑制腎小管上皮細胞損傷的策略迫在眉睫。環狀RNA(circRNA)是一類具有共價閉合環的非編碼RNA，其通過與特定的微小RNA(miRNA)結合，減輕miRNA對靶mRNA的抑制作用，參與急性腎損傷、腎細胞癌、DN等多種腎臟疾病的進展[3-5]。研究報道circ_0041795在高糖誘導的人視網膜色素上皮細胞中表達上調，沉默circ_0041795可抑制高糖誘導的炎性反應和細胞凋亡，促進細胞增殖，是治療糖尿病視網膜病變的潛在靶點[6]。然而circ_0041795在DN進展中的作用并不清楚。靶基因預測顯示miR-361-3p是circ_0041795的潛在靶點。有研究報道在高糖誘導的人臍靜脈細胞損傷中miR-361-3p表達降低，過表達miR-361-3p可抑制高糖誘導的血管內皮損傷，是糖尿病內皮損傷治療靶點[7]。本研究探討circ_0041795對高糖誘導的人腎小管上皮細胞損傷的影響，并通過miR-361-3p分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2購于中國科學院上海細胞庫；DMEM培養液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購于武漢普諾賽生命科技公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒購于北京天根生化科技公司；Power SYBR green master mix購于美國ABI公司；miRNA反轉錄試劑盒、細胞計數試劑盒(CCK-8)、雙熒光素酶活性測定試劑盒購于北京百奧萊博科技公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海凱基生物公司；兔源Cleaved-caspase3抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、羊抗兔IgG二抗購自美國CST公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染和分組:①HK-2細胞在DMEM培養液中培養，該培養基添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養箱條件為在37℃、含5%CO2。將對數期HK-2細胞鋪6孔板，當細胞生長至約60%匯合時，利用Lipofectamine 2000分別轉染si-circ_0041795、si-NC、miR-361-3p mimics、miR-NC、anti-miR-361-3p、si-circ_0041795+anti-miR-361-3p至HK-2細胞，收集轉染48 h細胞進行后續實驗。②實驗分組：正常糖(NG)組：用含有5.5 mmol/L葡萄糖DMEM培養液孵育HK-2細胞；高糖(HG)組：用含30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液孵育HK-2細胞[8]；HG+si-NC組、HG+si-circ_0041795組、HG+miR-NC組、HG+miR-361-3p組、HG+anti-miR-361-3p組、HG+si-circ_0041795+anti-miR-361-3p組：用含30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液分別孵育轉染si-NC、轉染si-circ_0041795、轉染miR-NC、轉染miR-361-3p mimics、轉染anti-miR-361-3p、轉染si-circ_0041795+anti-miR-361-3p的HK-2細胞。培養48 h后，收集細胞進行功能分析。

1.2.2 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測circ_0041795和miR-361-3p表達:Trizol法提取各組HK-2細胞的總RNA。為檢測circ_0041795表達，利用cDNA第一鏈合成試劑盒將1 μg總RNA轉化為cDNA，利用Power SYBR green master mix進行RT-qPCR。為檢測miR-361-3p，采用miRNA反轉錄試劑盒合成cDNA，再用miRNA熒光定量檢測試劑盒進行RT-qPCR。GAPDH和U6分別作為circRNA和miRNA的內源性對照。2-△△Ct法計算circ_0041795和miR-361-3p表達量。circ_0041795上游引物5’-CCAAGGAGTG TGCC CC TTTT-3’，下游引物5’-AGTCATGGTAAACCAGCCGAT-3’；GAPDH上游引物5’-GGTGGTC TCCTCTGACTTCAA-3’，下游引物5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’；miR-361-3p上游引物5’-ACACTCCAGCTGGGTCCCCCAGGTGTGATTC-3’，下游引物5’-CTCAACT GG TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCAGA-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGG CAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞存活率:將轉染HK-2或未轉染細胞以2×103個/孔的密度接種在96孔板中，根據不同實驗進行細胞處理。將10 μl的CCK-8溶液添加到每個孔中，然后在37℃下孵育2 h，酶標儀讀取450 nm處的吸光度(A)以表示細胞活力。存活率(%)=(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:用胰蛋白酶消化1×106個HK-2細胞，用預冷的PBS洗滌2次。將細胞重懸在500 μl結合緩沖液中，加入5 μl PI和5 μl AnnexinV-FITC在暗室染色20 min。流式細胞儀收集熒光信號，FlowJo 8.7.1軟件分析細胞凋亡率。

1.2.5 蛋白印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達:全蛋白提取試劑盒分離各組HK-2細胞總蛋白。定量后，將適量蛋白與等體積2×上樣緩沖液混合均勻，煮沸3 min使其變性。取30 μg蛋白樣品經SDS-PAGE分離后，轉移蛋白到聚偏二氟乙烯膜。室溫環境下將膜在5%牛血清蛋白中封閉2 h，然后用一抗(Cleaved-caspase3和GAPDH抗體1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。室溫環境下用相應的二抗(1∶2 000稀釋)孵育膜1 h。按照化學發光試劑盒說明書進行顯色反應，凝膠成像系統分析Cleaved-caspase3蛋白表達水平。

1.2.6 試劑盒檢測SOD活性、MDA含量以及LDH釋放:HK-2細胞處理完畢后，分別收集細胞培養液上清、細胞沉淀至新的離心管中。采用LDH檢測試劑盒檢測細胞培養液上清中LDH水平。向細胞沉淀中加入提取液，超聲破碎細胞，收集上清液，采用SOD活性檢測試劑盒、MDA含量測定試劑盒檢測細胞內SOD活性和MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗:合成含有miR-361-3p預測位點序列的circ_0041795野生型(wt)序列片段或突變型(mut)序列片段，將上述片段插入到psiCHECK-2載體，構建重組質粒wt-circ_0041795、mut-circ_0041795。利用Lipofectamine 2000將上述重組質粒分別與miR-361-3p mimics、miR-NC轉染HK-2細胞，培養48 h后用雙熒光素酶活性測定試劑盒測定各組細胞的相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 沉默circ_0041795或過表達miR-361-3p對高糖誘導的HK-2損傷的影響 與NG組比較，HG組HK-2細胞circ_0041795表達量、Cleaved-caspase3蛋白表達量、凋亡率顯著升高(P<0.05)，細胞存活率、miR-361-3p表達量顯著降低(P<0.05)；與HG組、HG+si-NC組比較，HG+si-circ_0041795組HK-2細胞circ_0041795表達量、Cleaved-caspase3蛋白表達量、凋亡率顯著降低(P<0.05)，細胞存活率、miR-361-3p表達量顯著升高(P<0.05)；與HG組、HG+miR-NC組比較，HG+miR-361-3p組HK-2細胞Cleaved-caspase3蛋白表達量、凋亡率顯著降低(P<0.05)，細胞存活率、miR-361-3p表達量顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 沉默circ_0041795或過表達miR-361-3p對HK-2凋亡的影響；A 沉默circ_0041795或過表達miR-361-3p對HK-2中Cleaved-caspase3蛋白表達的影響;B 沉默circ_0041795或過表達miR-361-3p均可抑制高糖誘導的HK-2凋亡

表1 沉默circ_0041795或過表達miR-361-3p對HK-2細胞活性和凋亡的影響

2.2 沉默circ_0041795或過表達miR-361-3p對高糖誘導的HK-2氧化應激的影響 與NG組比較，HG組HK-2細胞MDA含量、LDH釋放量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與HG組、HG+si-NC組比較，HG+si-circ_0041795組HK-2細胞MDA含量、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)；與HG組、HG+miR-NC組比較，HG+miR-361-3p組HK-2細胞MDA含量、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 沉默circ_0041795或過表達miR-361-3p對HK-2氧化應激的影響

2.3 circ_0041795靶向miR-361-3p Circular RNA Interactome預測顯示circ_0041795與miR-361-3p序列間存在特異性結合位點。雙熒光素酶胞實驗顯示，與miR-NC和wt-circ_0041795共轉染比較，miR-361-3p mimics和wt-circ_0041795共轉染后HK-2細胞的相對熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；與miR-NC和mut-circ_0041795共轉染比較，miR-361-3p mimics和mut-circ_0041795共轉染后HK-2細胞的相對熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 circ_0041795和miR-361-3p的互補序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4 抑制miR-361-3p可逆轉沉默circ_0041795對高糖誘導的HK-2損傷的影響 與HG組比較，HG+si-circ_0041795組HK-2細胞存活率、miR-361-3p表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+ anti-miR-361-3p組HK-2細胞存活率、miR-361-3p表達量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與HG+si-circ_0041795組比較，HG+ si-circ_0041795+anti-miR-361-3p組HK-2細胞存活率、miR-361-3p表達量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 抑制miR-361-3p可逆轉沉默circ_0041795對HK-2凋亡的影響

表4 抑制miR-361-3p可逆轉沉默circ_0041795對高糖誘導的HK-2損傷的影響

2.5 抑制miR-361-3p可逆轉沉默circ_0041795對高糖誘導的HK-2氧化應激的影響 與HG組比較，HG+si-circ_0041795組HK-2細胞MDA含量、SOD活性顯著升高(P<0.05)，LDH釋放量顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+anti-miR-361-3p組HK-2細胞MDA含量、SOD活性顯著降低(P<0.05)，LDH釋放量顯著升高(P<0.05)；與HG+si-circ_0041795組比較，HG+si-circ_0041795+anti-miR-361-3p組HK-2細胞MDA含量、SOD活性顯著降低(P<0.05)，LDH釋放量顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-361-3p可逆轉沉默circ_0041795對高糖誘導的HK-2氧化應激的影響

3 討論

研究證實circRNA參與DN進展的多個生物學過程。circ_15698在DN小鼠和小鼠系膜細胞中高表達，其通過與miR-185相互作用增加轉化生長因子-β1蛋白水平，促進纖維化相關蛋白合成[9]。circRNA低密度脂蛋白受體相關蛋白6(circLRP6)調節高糖誘導的系膜細胞增殖、氧化應激、細胞外基質(ECM)積累和炎性反應[10]。circ_0003928通過靶向miR-151-3p并上調Anxa2促進糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎性反應[11]。上述表明circRNA可能是DN治療的潛在治療靶標。本研究發現高糖刺激后HK-2細胞circ_0041795表達量顯著增加，提示circ_0041795高表達可能有助于DN進展。功能分析表明，沉默circ_0041795表達可抑制高糖誘導的細胞凋亡，提高細胞存活率，抑制Cleaved-caspase3蛋白表達。持續高血糖可增加活性氧的產生，當超過機體內源性抗氧化能力時，導致MDA產生、細胞損傷以及LDH釋放[12]。SOD是DN大鼠重要的抗氧化防御系統，與健康大鼠比較DN大鼠中SOD表達顯著減少[13]。因此，MDA、LDH和SOD是DN中氧化應激損傷的生物標志物。本研究中高糖刺激導致HK-2細胞、SOD活性降低，凋亡率、MDA水平、LDH釋放增加，表明高血糖促進氧化應激、加重腎小管上皮細胞損傷。沉默circ_0041795可增加HK-2細胞活力，抑制氧化應激和細胞凋亡，這與前期報道沉默circ_0041795可減輕高糖誘導的視網膜色素上皮細胞損傷[6]一致。因此，靶向circ_0041795可能是治療DN小管上皮損傷的重要策略。

迄今為止，circRNA的最典型的調控方式是miRNA分子海綿作用。最近研究證實一些circRNA在DN中表達失調，并通過miRNA調控DN進展，如circ_0080425在DN小鼠和高糖誘導的系膜細胞中上調，circ_0080425通過競爭性結合miR-24-3p促進系膜細胞增殖和纖維化，促進DN進展[14]。本研究中通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-361-3p是circ_0041795的下游靶點。目前已在宮頸癌、非小細胞肺癌、阿爾茨海默病(AD)、糖尿病血管并發癥中發現了異常表達的miR-361-3p[15-17,7]。研究報道AD細胞模型中miR-361-3p下調，過表達miR-361-3p可抑制β-淀粉樣蛋白誘導的細胞凋亡、氧化應激和炎性反應，抑制AD進展[18]。本研究探討miR-361-3p在DN進展中的作用，結果表明miR-361-3p在高糖誘導的HK-2細胞中表達下調，這與其在高糖誘導的血管內皮細胞損傷中的下調[7]相一致。功能分析證實，miR-361-3p過表達可抑制高糖誘導的HK-2細胞凋亡和LDH釋放，提高細胞存活率、SOD活力，降低MDA水平和Cleaved-caspase3蛋白表達量。沉默circ_0041795后高糖誘導HK-2中miR-361-3p表達顯著升高，且過表達miR-361-3p與沉默circ_0041795對高糖誘導HK-2細胞損傷的保護作用一致，提示circ_0041795可能靶向miR-361-3p調控高糖誘導HK-2細胞損傷。此外，本研究顯示抑制circ_0041795表達則加劇高糖誘導HK-2細胞損傷，并逆轉沉默circ_0041795對高糖誘導HK-2細胞凋亡和氧化應激損傷的影響，這進一步證實沉默circ_0041795對高糖誘導HK-2細胞損傷的保護作用是通過靶向上調miR-361-3p表達實現的。

綜上所述，沉默circ_0041795可通過抑制氧化應激和細胞凋亡來抵抗高糖誘導的人腎小管上皮細胞損傷，其機制與靶向上調miR-361-3p表達有關，這些發現為治療DN提供了新的潛在有效靶點。