MALDI-TOF MS用于耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌的同源性分析*

張河林，張 敏，趙秀林，趙平森△

1.粵北人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東韶關(guān) 512026；2.廣東藥科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510030；3.粵北人民醫(yī)院胃腸外科，廣東韶關(guān) 512026

陰溝腸桿菌作為條件致病菌，廣泛分布于自然界，是人類正常微生物菌群的一部分，常引起下呼吸道、泌尿道、手術(shù)部位和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等感染。該菌可產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或質(zhì)粒介導(dǎo)的Amp C酶，由于使用三代頭孢菌素容易誘導(dǎo)該酶的高表達(dá)，所以臨床上常常選用碳青霉烯類藥物進(jìn)行治療[1-2]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌(CRECL)檢出率不斷升高，給臨床治療CRECL感染帶來(lái)極大困難。而流行病學(xué)分析則是監(jiān)測(cè)感染暴發(fā)以及控制醫(yī)院感染的重要手段[3]。目前細(xì)菌同源性分析的方法多為基因水平，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)等，這些方法分型雖然準(zhǔn)確、可靠，但成本高，周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)且需要專業(yè)的技術(shù)人員。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)與上述方法原理不同，不僅能夠準(zhǔn)確、快速鑒定到屬、種，甚至是亞種，而且還具有高通量的特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外均有研究報(bào)道將MALDI-TOF MS技術(shù)應(yīng)用于多重耐藥菌的同源性分析[4-5]，但少見(jiàn)用于CRECL的同源性分析。本研究旨在明確粵北人民醫(yī)院病房是否存在CRECL的克隆傳播，評(píng)價(jià)MALDI-TOF MS的主成分分析(PCA)和核心圖譜(MSP)聚類分析用于CRECL同源性分析的可行性。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2018年8月至2019年6月從粵北人民醫(yī)院住院患者中分離的非重復(fù)CRECL菌株共10株，編號(hào)為YG1～YG10，排除無(wú)法進(jìn)行PFGE分型的YG10,共納入9株菌株(YG1～YG9)。

1.2儀器與試劑 VITEK 2 Compact(法國(guó)梅里埃)全自動(dòng)微生物分析儀(包括比濁儀)及其配套試劑，Microflex LT(德國(guó)布魯克公司)質(zhì)譜儀及其配套試劑，藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)，CHEF Mapper XA 脈沖場(chǎng)電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，ChemiDoc MP型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，內(nèi)切酶XbaⅠ體系(日本TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1鑒定及藥物敏感試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)) 臨床分離的陰溝腸桿菌同時(shí)采用VITEK 2 Compact生化鑒定和Microflex LT質(zhì)譜鑒定，藥敏試驗(yàn)采用VITEK 2 Compact系統(tǒng)的MIC法(儀器法)和K-B法。結(jié)果判讀及解釋根據(jù)CLSI文件第28版M100進(jìn)行。生化鑒定及藥敏的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，質(zhì)譜儀采用布魯克配套的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品(BTS)。

1.3.2PFGE分析 參照文獻(xiàn)[6]對(duì)細(xì)菌進(jìn)行同源性分析：取200 μL經(jīng)培養(yǎng)后的菌液與低熔點(diǎn)膠1∶1包埋，蛋白酶K和內(nèi)切酶XbaⅠ在37 ℃水浴中酶切3 h；PFGE條件及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.3MALDI-TOF MS同源性分析 將9株(編號(hào)YG1～YG9)陰溝腸桿菌接種于新鮮的血平板，置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)18～24 h，用滅菌牙簽挑取單個(gè)菌落的少量細(xì)菌均勻涂布在96孔金屬靶板孔位上，晾干后加1 μL 70%甲酸溶液均勻涂覆在標(biāo)本上，待晾干后再加1 μL基質(zhì)溶液均勻涂覆在標(biāo)本上，晾干后把96孔金屬靶板放入質(zhì)譜儀中上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果用Biotyper 3.1軟件進(jìn)行同源性分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以率表示。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果 9株陰溝腸桿菌對(duì)頭孢呋辛、頭孢曲松、氨曲南及頭孢吡肟全部耐藥，同時(shí)對(duì)哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑合劑也表現(xiàn)出高度耐藥；雖然9株陰溝腸桿菌都對(duì)厄他培南全部耐藥，但YG4對(duì)亞胺培南(IPM)中介，而YG1和YG9卻對(duì)亞胺培南敏感。9株陰溝腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物阿米卡星(AMK)的耐藥率(11.1%)相對(duì)最低，AMK具有較好的抗CRECL效果；其次，對(duì)喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星(LVX)的耐藥率為55.6%，對(duì)磺胺類抗菌藥物復(fù)方磺胺甲噁唑(SXT)的耐藥率為66.7%，但對(duì)二者的耐藥率均超過(guò)了50.0%。其中YG2、YG5和YG8的耐藥譜一樣，具體藥敏結(jié)果(不同部分)見(jiàn)表1。

表1 9株陰溝腸桿菌的臨床分布及部分藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2PFGE同源性分析結(jié)果 根據(jù)PFGE判讀標(biāo)準(zhǔn)(相似度100%的為同一型別；≥7個(gè)條帶有差異被認(rèn)為在流行病學(xué)上無(wú)相關(guān)性)，9株陰溝腸桿菌之間均存在7條以上的條帶有差異，其中YG4和YG5的相似度最高(67%)，其他的相似度都低于50%，因此9株陰溝腸桿菌在流行病學(xué)上無(wú)相關(guān)性，分為9型，見(jiàn)圖1。

圖1 9株陰溝腸桿菌PFGE圖

2.3MALDI-TOF MS同源性分析結(jié)果 采用MALDI-TOF MS分析軟件MALDI Biotyper 3.1對(duì)9株陰溝腸桿菌進(jìn)行同源性分析，比較9株菌株質(zhì)譜蛋白峰的數(shù)目與質(zhì)荷比大小(位置)。MSP聚類分析樹(shù)狀圖顯示，以水平線距離300作為分型標(biāo)準(zhǔn)，最終將9株陰溝腸桿菌分為3型：YG1、YG3、YG6和YG7為A型，YG2、YG4、YG5和YG8為B型，YG9為C型，其中A型中的YG3、YG7及B型中的YG2、YG5的水平線距離均為0，見(jiàn)圖2。PCA聚類分析樹(shù)狀圖顯示：YG1和YG9的水平線距離較近，歸為A型；YG2、YG4、YG7和YG8的水平線距離較近，歸為B型；YG3、YG5和YG6的水平線距離較近，歸為C型，見(jiàn)圖3。

圖2 9株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌的MSP聚類分析樹(shù)狀圖

圖3 9株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌的PCA聚類分析樹(shù)狀圖

3 討 論

陰溝腸桿菌是一種重要的條件致病菌，隨著頭孢菌素在臨床的廣泛使用，陰溝腸桿菌日漸成為引起醫(yī)院感染的重要病原體。由于臨床治療中碳青霉烯類抗菌藥物使用不規(guī)范，部分陰溝腸桿菌出現(xiàn)耐藥趨勢(shì)，嚴(yán)重影響臨床抗感染工作[8-9]。因此，快速鑒定陰溝腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行分型，并掌握其流行病學(xué)相關(guān)信息，對(duì)陰溝腸桿菌感染進(jìn)行控制和治療十分重要。

PFGE因?yàn)榉中椭讣y圖譜圖像分辨力強(qiáng)，結(jié)果辨識(shí)度和重復(fù)性好，操作標(biāo)準(zhǔn)化，并且有成熟的分型結(jié)果數(shù)據(jù)庫(kù)，被國(guó)內(nèi)外分子流行病學(xué)者廣泛認(rèn)同，被認(rèn)為是微生物亞種分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10-11]，但是由于其對(duì)臨床工作的指導(dǎo)意義受限，設(shè)備要求高，技術(shù)操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)等不足，難以在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣運(yùn)用[12]。而MALDI-TOF MS作為一種快速細(xì)菌分型的新興方法，不僅可以鑒定細(xì)菌，還可以通過(guò)細(xì)菌的蛋白質(zhì)圖譜對(duì)細(xì)菌進(jìn)行同源性分析，為臨床精準(zhǔn)防控多重耐藥的陰溝腸桿菌提供指導(dǎo)。

本試驗(yàn)以PFGE同源性分型為金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)PFGE分型，9株陰溝腸桿菌被分為9種不同的型，在流行病學(xué)上無(wú)相關(guān)性。MSP、PCA聚類分析結(jié)果與PFGE分型結(jié)果相差較大，結(jié)果顯示MSP、PCA聚類分析與PFGE分型基本無(wú)關(guān)聯(lián)性。此外，雖然都是質(zhì)譜分型，但MSP聚類分析與PCA聚類分析的結(jié)果也有很大的差別。MSP聚類分析顯示：YG3、YG7的水平線距離為0，推斷2株為同一克隆菌株的可能性極大；而YG2、YG5的水平線距離也為0，推斷2株為另外同一克隆菌株的可能性極大。PCA聚類分析顯示：YG3、YG6水平線距離均小于0.5，推斷2株可能為同一克隆菌株來(lái)源；而YG2和YG7的水平線距離也小于0.5，推斷2株可能為另外同一克隆菌株來(lái)源。MALID-TOF MS的2種同源性分析將YG3和YG6分到同一型中，而將YG2、YG4和YG8分到另外同一型中，與PFGE分型結(jié)果相差較大。分析其可能原因：(1)PFGE是通過(guò)細(xì)菌的DNA進(jìn)行同源性分型，穩(wěn)定性較好，準(zhǔn)確度較高，但在本研究中YG10重復(fù)2次試驗(yàn)后仍不能產(chǎn)生可供分析的電泳條帶，無(wú)法進(jìn)行PFGE分型，可能是CRECL對(duì)內(nèi)切酶XbaⅠ產(chǎn)生了抗性或缺乏相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，文獻(xiàn)[13]認(rèn)為這是因DNA降解所致，但是文獻(xiàn)[14]報(bào)道在電泳緩沖液中加入了抑制DNA降解的硫脲后仍未產(chǎn)生電泳條帶，故具體原因有待進(jìn)一步研究。(2)MALDI-TOF MS主要是通過(guò)檢測(cè)不同菌株所表現(xiàn)的獨(dú)特蛋白峰進(jìn)行同源性分析，培養(yǎng)時(shí)間、溫度、環(huán)境、檢測(cè)條件等因素均可影響蛋白質(zhì)的表達(dá)及含量[15]，雖然此次分型所用的蛋白質(zhì)譜圖都是鑒定分值在2.3以上的高質(zhì)量質(zhì)譜圖，但是PC1+PC2方差總和卻沒(méi)有達(dá)到80%，這也是導(dǎo)致MALDI-TOF MS分型結(jié)果與PFGE分型結(jié)果有所差異的原因之一，但是質(zhì)譜分型可以對(duì)那些不能PFGE分型的菌株進(jìn)行MSP聚類分析或PCA聚類分析，彌補(bǔ)了PFGE分型的不足。因此，在使用MALDI-TOF MS進(jìn)行同源性分型時(shí)，需要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行同源性分析。此外文獻(xiàn)[16]報(bào)道，使用ClinPro Tools 3.0軟件篩選信噪比、變異系數(shù)及質(zhì)量峰信噪比的比值等符合要求的特征峰來(lái)提高質(zhì)譜分型的靈敏度和特異度。

綜上所述，本次研究表明粵北人民醫(yī)院病房不存在CRECL克隆傳播，雖然MALDI-TOF MS能夠?qū)?shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行快速鑒定，也可成功進(jìn)行同源性分型，有一定的分辨力，但目前還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜操作流程，尚不能對(duì)MSP聚類分析和PCA聚類分析結(jié)果下定論。因此，應(yīng)繼續(xù)深入研究該技術(shù)，探索一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)譜操作流程，為臨床抗感染工作提供一個(gè)快速簡(jiǎn)便的方法。