楊山牡丹生防內生細菌的分離及鑒定

劉雪停，夏彥飛,2*，李 身，雷榮月，徐建強，林曉民*

（1.河南科技大學，河南 洛陽 471003；2.桂林醫學院 附屬醫院，廣西 桂林 541001）

楊山牡丹（Paeonia ostii）是我國傳統花卉牡丹（P. suffruticosa）的1個栽培品種，除了具有觀賞價值外，因其根具有鎮痛、消炎、抗腫瘤等功效，也被廣泛應用在醫學研究領域［1-2］。隨著種植面積的持續擴增及病害的逐年積累，牡丹病害種類越來越多，危害也逐年加重。大量牡丹病害的發生導致了牡丹花色衰退、生長受阻、藥用價值下降，嚴重制約了牡丹產業化的發展［3］。目前，已記錄的牡丹病害種類有27種，主要有牡丹灰霉病、牡丹黑斑病、牡丹黃斑病和牡丹線蟲病等［4］?；瘜W藥劑具有防效好、見效快的特點，施用化學藥劑一直是牡丹病害防治的主要手段，但是大量化學藥劑的使用給人類健康和環境安全帶來了隱患，導致不少藥劑被禁用或即將禁用，因此，開發高效、無毒的微生物制劑已成為控制牡丹病害的研究熱點，也符合可持續發展和綠色環保的理念［5-6］。

植物內生菌是指能存活于健康植物組織內部的一類微生物，具有獨立繁殖和傳導特性，其與寄主植物長期協同進化，產生與寄主相同或相似的生物活性物質，因此人們對此類微生物產生了極大的興趣［7-10］。研究表明，植物內生細菌具有促進植物生長，提高寄主植物的抗病性，增強植物對環境的抗逆性等特性［11-14］。已報道的植物內生細菌主要集中在變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria ） ；常見的植物內生細菌屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、微球菌屬（Micrococcus）、泛菌屬（Pantoea）、寡單胞菌屬（Stenotrophomonas）、微桿菌屬（Microbacterium）［15-16］。 目前，已報道具有生防作用的牡丹內生細菌為芽孢桿菌屬的6個種，分別是解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、短小芽孢桿菌（B. pumilu）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、假真菌樣芽孢桿菌（B. pseudomycoides）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）和貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）［17-19］。總體來看，關于牡丹生防內生細菌的研究偏少，鑒于此，筆者對楊山牡丹內生細菌進行了分離鑒定，并對其抑菌機制進行了初步研究，旨在篩選出能產生抑菌活性物質的生防內生細菌，為牡丹病害的生物防治提供新的微生物菌種資源。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

采取6、7月份洛陽市各牡丹園區內的楊山牡丹植株的根、莖、葉，收集新鮮樣本后立即帶回實驗室，用自來水清洗干凈。

1.2 培養基

本研究所用的PDA培養基、LB固態培養基、LB液體培養基的配制及滅菌方法參照《現代微生物學實驗技術》［20］。細菌發酵培養基為Landy培養基，具體配方參考Landy等的研究方法［21］。

1.3 指示植物病原菌

牡丹黑斑病菌（Alternaria suffruticosae）、牡丹黃斑病菌（Phyllosticta commonsii）、牡丹腔孢葉斑病菌（Hainesia lythri）、牡丹灰霉病菌（Botrytis paeoniae）、北方根結線蟲（Meloidogyne arenaria）均為本實驗室保存。

1.4 牡丹內生細菌的分離和純化

取植株根、莖和葉，先用自來水沖洗干凈，再用無菌水清洗3~5次，然后按照楊瑞先等的方法進行表面滅菌；取最后1次漂洗植物組織的無菌水涂布平板，檢查滅菌效果［17］。向各消毒組織加入10 mL無菌水，研磨；吸取研磨液，采用稀釋涂平板法將其涂布于LB固體培養基，在28 ℃恒溫培養箱倒置培養48 h。挑出菌落形態各異的單菌落進一步純化分離，在4 ℃下保存。

1.5 拮抗菌株的篩選

對挑取的純培養菌株用Landy培養基進行發酵培養，利用平板對峙法和浸漬法篩選出有拮抗活性的內生細菌。發酵培養條件參考Landy等的方法［21］。收集培養濾液，在4 ℃下以12000 r/min的轉速離心20 min；取上清液，過0.22 μm微孔濾器，此過濾液即為內生菌上清液。

在PDA平板中心分別接種直徑為5 mm的4種牡丹病原真菌菌餅，將內生菌上清液5 μL用十字交叉法接種在距離菌餅2 cm的滅菌濾紙片上，置于28 ℃恒溫培養箱培養。待對照病原菌菌絲長滿平板時，測量其抑制效果；實驗獨立重復3次。采用同樣的方法對有抑菌作用的內生菌株進行復篩，并在顯微鏡下觀察生防菌株拮抗部分病原真菌菌落邊緣菌絲的生長形態；實驗獨立重復3次。

內生細菌對北方根結線蟲的拮抗活性實驗參考Xia等的方法［22］，即先將2 mL內生菌上清液放入直徑為6 cm的滅菌表面皿中，然后挑入50條北方根結線蟲2齡幼蟲，置于25 ℃培養箱，12 h后統計線蟲的死亡數；實驗重復3次。用無菌水和無菌Landy培養基作為對照；實驗獨立重復3次。對有殺線蟲效果的菌株采用同樣的方法進行復篩；實驗獨立重復3次。

1.6 生防內生細菌的鑒定

對有拮抗活性的牡丹內生菌進行形態和生理生化鑒定，具體方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》［23］和《原核生物進化與系統分類學實驗教程》［24］。

利用Axygen DNA提取試劑盒提取拮抗菌株的基因組。細菌16S rDNA擴增所用引物為27F（5＇-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇）和1492R（5＇-GGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）。gyrB基 因擴增簡并引物為UP-2r（5＇-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3＇）和UP-1（5＇-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3＇）（Y代表C或者T；M代表A或者C；R代表A或者G；N表示任一堿基）。用Axygen膠回收試劑盒回收目的片段，并將其送南京思普金生物科技有限公司測序。將菌株的16S rDNA和gyrB基因的測序序列與GenBank中已登錄的序列進行BLAST比對，確定與該菌株親緣關系最近的種屬，獲取相似性較高的相關種的序列。將拮抗菌株和相關屬的16S rDNA和gyrB基因序列分別進行拼接，用ClustalX軟件進行多序列比對，應用Mega 4.0的Neighbor-Joining（NJ）方法構建系統發育樹（穩定性檢測重復取樣1000次），并進行聚類分析。

1.7 數據分析

實驗所得數據采用SPSS 20.0軟件（SPSS inc.， Illinois， USA）的單因素方差分析方法（ANOVA）進行顯著性檢驗，用最小顯著性差數法（Least Significant Difference， LSD）進行兩兩比較，以P<0.05作為檢驗差異顯著性的標準。

2 結果與分析

2.1 楊山牡丹內生細菌的分離和篩選

根據細菌菌落形態的不同，本研究共從楊山牡丹的根、莖、葉組織中分離出211株內生細菌，其中從根分離出41株，從莖分離出155株，從葉分離出15株。經初篩，有42個菌株的發酵上清液對4種牡丹病原真菌和北方根結線蟲具有拮抗活性。對這42株菌株進行復篩，其中6株內生細菌（YMG34、YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143、YMY13）表現出穩定的拮抗活性，用其上清液處理北方根結線蟲12 h，線蟲的死亡率均為100%。菌株YMG34對黃斑病菌和黑斑病菌的抑制直徑最大，其抑制效果與YMJ78、YMJ143、YMY13的處理存在顯著差異；菌株YMG34對灰霉病菌的抑制直徑為31.89 mm，與菌株YMJ78和YMY13的處理也存在顯著差異；YMJ78菌株對腔胞葉斑病菌的抑制直徑最大，為32.22 mm，與菌株YMJ141的處理存在顯著差異（表1）。

表1 6株內生細菌菌株對牡丹病原真菌的抑制作用

2.2 拮抗生防內生細菌的鑒定

6株菌株的生理生化特征（表2）與《常見細菌系統鑒定手冊》描述的芽孢桿菌屬的特征基本一致，初步鑒定這6株生防菌屬于芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）［6］。

6株生防內生細菌的16S rDNA和gyrB基因的核酸測序序列長度見表3。將6株內生菌株的16S rDNA和gyrB序列分別在GenBank數據庫進行比對，結果顯示都與芽孢桿菌屬部分菌株的基因序列相似度最高。把這6株生防內生細菌及選取的同源性較高的芽孢桿菌菌株的16S rDNA和gyrB基因的序列分別拼接后，采用Mega 4.0構建系統發育樹，如圖1所示，菌株YMG34與巨大芽孢桿菌處于同一分支中；YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143以及YMY13與耐鹽芽孢桿菌聚在一個分支上。分別結合6個菌株的生理生化特性，YMG34菌株被鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），菌株YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143和YMY13被鑒定為耐鹽芽孢桿菌（Bacillus halotolerans）。

2.3 拮抗生防內生細菌對病原菌菌絲生長抑制效果的顯微觀察

牡丹黃斑病原菌、黑斑病原菌、灰霉病原菌受內生細菌菌株YMG34、YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143、YMY13抑制后，其病原菌菌絲生長明顯受阻。在光學顯微鏡（10×40倍）下觀察對峙平板中邊緣菌絲的變化情況，與對照菌絲（圖2中的CK1、CK2、CK3）比較，受生防細菌抑制的病原菌菌絲縮短變粗，生長變形扭曲，有瘤狀突起、縊縮、細胞膨大等畸變（圖2中的A、B、C、E、F、G、I、J、K、M、N、O、Q、R、S、U、V、W）。腔胞葉斑病原菌受6株內生細菌作用后，菌落周圍區域變為深褐色，除了YMY13菌株的處理能在10×40倍光學顯微鏡下觀察到菌絲的變化狀況外，其余拮抗菌的處理只能在10×20倍下觀察到結果。腔胞葉斑病原菌的菌絲受YMY13菌株處理后，也變粗縮短，生長變形扭曲，有瘤狀突起、縊縮、細胞膨大等畸變現象（圖2X），而該菌株受其余5株拮抗菌處理后，只能看到瘤狀突起（圖2中的D、H、L、P、T）。

表2 6株內生細菌菌株的生理生化特征

表3 6株內生細菌菌株的16S rDNA及gyrB基因的序列長度

圖1 基于16S rDNA和gyrB基因序列串聯構建的6株內生細菌的系統進化樹

圖2 6株內生細菌菌株對牡丹病原真菌菌絲的影響

3 結論與討論

近年來，隨著人們對牡丹觀賞價值、藥用價值以及食用價值認識的不斷深入，牡丹種植面積逐漸增多，品種多樣化，結果導致植物病害越來越多，危害也逐年加劇。芽孢桿菌屬細菌具有抗逆性強的芽孢，可以產生多種抗菌物質，非常有利于微生物農藥的開發和推廣。因此，利用芽孢桿菌來控制牡丹病害成為新的研究熱點。如楊瑞先等先后從牡丹根部分離出6株芽孢桿菌菌株，其對牡丹黑斑病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、黃斑病菌具有明顯的抑制作用［17－18］。分離于牡丹根部的枯草芽孢桿菌Md10菌株和短小芽孢桿菌Md20菌株對金黃色葡萄球菌具有抑菌活性。

本研究也從牡丹組織內分離出共同拮抗牡丹黃斑病原菌、黑斑病原菌、灰霉病原菌、腔胞葉斑病原菌及北方根結線蟲的6株內生細菌，其中根部1株（YMG34）、莖部4株（YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143）、葉部1株（YMY13）。在本研究中，除了這6株內生菌表現出穩定的廣譜抗性外，還有一些菌株對單一病害呈現了較強的拮抗活性（未發表數據）。本研究不僅充實完善了牡丹生防微生物菌種資源庫，而且為將來6株生防內生細菌菌株的進一步開發利用提供了理論依據。

16S rDNA基因序列是細菌分類常用的基因標記，但是很難對序列相似度較高的同源性芽孢桿菌種群進行區分，因此學者們開發了一些新靶標如gyrA、gyrB、rpoD等基因來區別芽孢桿菌的近緣種［25-27］。喻國輝等結合16S rDNA、gyrA、gyrB等基因將分離于石斛蘭的R13生防菌株鑒定為枯草芽孢桿菌［28］。郭潔心等采用同樣的研究方法，把從丁香樹莖部分離的1株植物生防內生細菌G-1菌株鑒定為甲基營養型芽孢桿菌［29］。本研究利用傳統形態鑒定、生理生化特征實驗、16S rDNA與gyrB基因聯合分析方法，成功鑒定出5株耐鹽芽孢桿菌（YMJ74、YMJ78、YMJ141、YMJ143和YMY13），以及1株巨大芽孢桿菌（YMG34菌株）。

植物內生細菌能利用代謝過程中產生的活性物質如伊枯草菌素、表面活性素、泛革素等來抑制植物病原菌的生長或蔓延［30］。據楊瑞先等報道，蘇云金芽孢桿菌Md1-14菌株、假真菌樣芽孢桿菌Md3-14菌株、貝萊斯芽孢桿菌Md2-17和Md2-35菌株的代謝產物對牡丹灰霉病原菌有顯著的抑制作用，導致病原菌菌絲縮短變粗、分支增多成簇狀、原生質體凝集等現象［18］。Xu等也發現枯草芽孢桿菌1-L-29菌株拮抗油茶炭疽病菌后，菌絲出現變形、膨大等現象［31］。本研究分離得到的6株內生菌的代謝產物也能抑制4種植物病原菌菌絲的生長，導致菌絲扭曲、變粗縮短、有瘤狀突起等畸變現象，表明這6株內生細菌具有防治牡丹病害的潛力。

盡管本研究確定6株生防內生菌對5種植物病原菌具有拮抗活性，但具體是何種物質起作用，其作用方式如何，是否會產生新的活性物質，以及田間對牡丹病害的防治效果如何，均有待進行下一步的試驗研究。