堿催化雙螺桿動態擠壓預處理小麥秸稈制備發酵用糖的研究

唐成倫，王松濤，趙愷晨，劉慶國，單軍強，陳彥君，朱晨杰*，沈才洪*

（ 1.江蘇集萃工業生物技術研究所有限公司,江蘇 南京 210032；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.南京工業大學，江蘇 南京 211816）

0 引言

木質纖維素類生物質具有綠色、低碳、清潔、可再生等特點，深入開發木質纖維素類生物質有利于我國碳中和的目標早日實現。但與淀粉類糧食作物不同的是，木質纖維素存在抗降解屏障阻礙其酶解轉化利用。預處理作為木質纖維素利用的必要手段，不僅要破壞木質纖維素的致密結構，還要提高利于酶水解碳水化合物的比表面積和孔徑。作為木質纖維素類生物質精煉第一步的預處理過程，其成本所占比例是影響下游生產過程的重要因素。目前，科學界與企業界已經開發了諸多預處理技術，如蒸汽爆破、稀酸、高溫水熱等預處理手段。但這些方法多為批次處理，采用高溫高壓處理，處理量小且能耗高，成本居高不下。作為機械預處理的螺桿動態擠壓技術可以解決以上問題，并以更低的成本進行連續化生產。

螺桿動態擠壓技術具有處理量大、剪切力高、保留時間短、物料傳質傳熱效率高以及易于放大等特點，是用于木質纖維素預處理的一種較為理想的可工業放大的生產裝備。螺桿動態擠壓技術通常可以配合化學催化劑協同處理，因為螺桿具有高效混合能力，采用較少的化學催化劑達到較理想的處理效果，從而降低工業廢水的處理量［1］。螺桿機械主要分為單螺桿與雙螺桿擠出機，但由于雙螺桿擠出技術具有更廣泛的應用基礎，因此，木質纖維素類生物質預處理更多采用雙螺桿擠出技術。而雙螺桿機械又分為同向雙螺桿與反向雙螺桿，da Sliva教授研究發現，反向雙螺桿設備存在螺旋磨損大的缺點，不適宜廣泛推廣應用；而同向雙螺桿由于其可以保持較高的轉速，因此，具有物料處理量大、剪切力大、混合及傳送效率高等優點［1］。本研究采用同向高速雙螺桿擠壓技術協同堿催化技術，處理了中國資源豐富的小麥秸稈，考察了催化劑用量和擠出后的保溫時間，并對碳水化合物保留率、木質素脫除率和預處理后物料的酶解得糖率的影響進行了研究，同時從預處理單位物料的能量輸入等角度對不同的預處理方式進行了對比評估。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

小麥秸稈來源于江蘇徐州。纖維素酶購于諾維信公司，其酶活力為245 FPU/mL。工業級氫氧化鈉。

1.2 實驗儀器

秸稈切割機，鼓式水洗機（400型）和氣動脫水機（500型）購自山東晨鐘股份有限公司，雙螺桿擠壓揉搓機（TEP80型）購自河北天正篩選制漿設備有限責任公司，秸稈處理量200 kg/h。

1.3 堿催化雙螺桿動態擠壓預處理

小麥秸稈切成3~5 cm的小段，將切好的秸稈放入鼓式水洗機中清洗，沉淀泥沙。把清洗好的秸稈放入雙螺桿擠出機進行機器預熱，使反應倉溫度提高。待反應倉溫度升高后，將配好的不同濃度、不同溫度的堿液加入到雙螺桿擠出機中進行反應（2段加催化劑，固液比為1∶2）。將擠出的物料裝入氣動脫水機擠出黑液，加入2倍的水，清洗擠出黑液。合并螺桿與氣動脫水機擠出的黑液，濃縮后調酸沉降得到木質素。處理后的秸稈用于結構分析與酶解制糖。

1.4 小麥秸稈的酶水解

取10.0 g小麥秸稈（原生和預處理后）加入到2 L水解釜中，加入去離子水，用硫酸調pH值為4.8后加入15 FPU/g（小麥秸稈）纖維素酶，在50 ℃的恒溫下以150 r/min，水解48 h，定時取樣，采用HPLC分析糖含量。檢測器為視差檢測器，色譜柱為Aminex HPX-87H ion exclusion column（300 mm ×7.8 mm；Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，美國），流動相為50 mol/L稀硫酸，在55 ℃下，洗脫速度為0.6 mL/min。

1.5 分析測試方法

1.5.1 小麥秸稈組分分析 小麥秸稈的組分分析參照美國可再生能源實驗室（NREL）標準分析方法進行測定［2］。取0.300 g絕干的小麥秸稈（原生和預處理后）加入到250 mL螺口瓶中，加入3 mL質量分數為72%的濃硫酸，將螺口瓶放入恒溫水浴搖床中30 ℃保溫1 h。反應后迅速加入84 mL蒸餾水將硫酸濃度稀釋至4%，放入高壓滅菌鍋中121 ℃反應1 h。反應結束后，固液分離，清洗殘渣，烘干稱重后，放入馬弗爐中575 ℃煅燒24 h，稱重。采用差量法測定酸不溶木質素與灰分的含量。液相一部分通過高效液相色譜進行糖含量測定，一部分采用紫外分光光度計205 nm測量酸溶木質素含量。

1.5.2 小麥秸稈微觀結構的表征 對預處理后的樣品進行冷凍干燥，可以較好地標尺預處理后樣品的原生結構［3］。采用掃描電鏡（FEI Quanta 200FEG SEM）對預處理前后小麥秸稈的表面結構進行表征，操作電壓5 kV，放大500倍。

采用X-射線衍射儀（Rigku ultima IV， 日本）測定預處理前后小麥秸稈的結晶度變化。將小麥秸稈過篩100目，掃描范圍10~40°，掃描速度為5 °/min。計算公式如下［4］：

其中：CrI表示結晶強度；I002表示結晶區衍射強度，2θ=22.5°；Iam表示無定形區衍射強度，2θ=18.7°。

樣品的紅外光譜（FTIR）采用美國傅里葉紅外光譜儀（Thermo Scientific Nicolet 6700）采集。采用溴化鉀（KBr）壓片法進行采集，取樣品與KBr按質量比1∶100均勻混合后研磨制成薄片，圖譜采集范圍4000~500 cm-1。

1.5.3 分離提取的木質素表征 木質素二維核磁（2D-HSQC）的采集采用德國Bruker 400 MHz核磁共振儀（Advance 400）采集。取90 mg木質素樣品溶解于0.5 mL DMSO-d6中。1H和13C 2個維度的譜寬分別為5000 Hz和20000 Hz。1H維度采樣點數為1024次，弛豫時間1.5 s，累加64次。13C維 度采樣點數為256次。碳氫耦合常數為145［5］。采用MestReNova軟件進行數據處理。

2 結果與討論

2.1 雙螺桿擠出機工作原理分析及螺旋結構變化對纖維的影響

機械預處理中的球磨、盤磨等其基本原理都是采用反復壓縮/減壓作用使纖維壁疲勞進而進行纖維的分離，但在減壓過程中釋放的能量大多轉化為熱能，這些熱能可以軟化纖維，與此同時，當溫度超過木質素的玻璃化溫度時，反而會使纖維變硬，不利于進一步的利用。與常規的粉碎和磨解預處理不同，雙螺桿擠壓揉搓預處理過程中利用壓縮力和剪切力使生物質按軸向分裂纖維化，這種作用力產生的熱量足以軟化木質素，而不超過木質素的玻璃化溫度，使纖維解離更多地發生在S1~S2層間，而不是胞間層。這對纖維細胞的初生壁和次生壁有極好的破壞作用，更有利于纖維素酶的酶解。

TEP80型雙螺桿擠壓揉搓機螺桿采用積木組合式結構，可根據工藝要求調整螺桿構型，螺桿由多組正壓輸送螺旋與多組反壓磨解螺旋構成（圖1）。由于螺桿采用多級螺旋解離纖維，因此通過調整螺旋的開口間隙可以控制纖維磨解的粗細程度。表1為未進行化學催化的中性雙螺桿擠壓預處理效果，螺旋組合中隨著最小開口徑的減小，酶解效果有所提升，主要是因為雙螺桿擠壓揉搓纖維，使纖維從細胞壁中暴露出來，增大了比表面積（圖2）。但隨著摩擦力的增大，能耗也有所提高，當螺旋開口減小到6 mm時，酶解效果并沒有明顯提高，反而單位處理量下降，因此，優選螺旋開口徑為8 mm。單純進行機械擠壓預處理纖維素酶解效果改善有限，主要是因為木質素在預處理過程中并沒有脫除，其對纖維素酶的無效吸附作用降低了纖維素酶水解纖維的效率［6］。

圖1 雙螺桿示意圖

圖2 預處理前后秸稈SEM圖

2.2 堿催化雙螺桿擠壓預處理對秸稈酶解的影響

中性雙螺桿擠壓雖然能夠有效破壞細胞壁初生壁與次生壁的解離纖維，但是由于預處理過程中半纖維素與木質素依然纏繞在纖維表面，影響了纖維素酶與纖維素的有效接觸，因此，纖維素的酶解效果并沒有大幅提升。堿催化的雙螺桿擠壓預處理已受到廣泛關注，由于螺桿擠壓可以有效解離纖維，堿性藥液更容易浸入纖維素內部，在擠壓纖維過程中摩擦產熱也加速了木質素大分子的斷裂溶出。

表1 螺旋開口對酶解效果的影響

2.2.1 預處理后樣品的組分分析 摩擦產熱效應預熱后螺桿機箱溫度可高達95 ℃以上，為化學催化的預處理提供了充足的熱能。由于螺桿的高速運轉，物料停留時間較短，因此，需對擠出料進行保溫反應。圖3為不同堿濃度及保溫時間下堿催化雙螺桿擠壓預處理后小麥秸稈中纖維素、半纖維素和木質素的含量變化圖。如圖3所示，堿催化雙螺桿擠壓預處理后纖維素的損失不會超過10%，主要是因為纖維素具有結晶結構，其致密結構降低了纖維素的降解程度［7］。在堿性條件下，纖維素損失的主要原因是其還原性末端發生了剝皮反應［8］，又因為雙螺桿擠壓揉搓機能夠解離纖維，產生的微纖維可能會溶解在濃堿液中，從而導致纖維素部分損失。相對于纖維素，半纖維素結構疏松，分支多、還原型末端多，因此，在堿性條件下，半纖維素更易產生降解［7］。如圖3所示，相對于物料擠出后的保留時間，堿濃度對半纖維素降解的影響更大。當堿濃度由0.2 g/g（小麥秸稈）提升到1.0 g/g時，剛擠出的物料中半纖維素的保留率由87.6%下降到66.1%。雖然隨著保溫反應時間的延長，半纖維素的保留率會降低，但其影響相對較小。因此，為了保留更多碳水化合物，需要選擇適宜的堿用量。木質素作為圍繞在纖維素周圍的物理屏障，其對纖維素酶的無效吸附作用嚴重影響了纖維素的酶解效率［6］。之前的研究也證明，木質素的脫除率與酶解糖得率存在一定的線性關系，酶解得糖率隨著木質素含量的降低而提高［9］。堿法預處理是木質素脫除最有效地方法之一，在堿性條件下，氫氧根離子可以攻擊木質素—碳水化合物復合結構（LCC）、皂化木質素與半纖維素之間的酯鍵，是木質素與碳水化合物之間的分離。并且在堿性條件下，木質素以陰離子形式存在，也利于其分離溶出［10］。同時，由于螺桿擠壓可以有效地解離纖維，堿性藥液更容易浸入纖維素內部，在擠壓纖維過程中摩擦產熱也加速了木質素大分子的斷裂溶出。因此，如圖3所示，在合適的堿用量條件下，堿催化雙螺桿擠壓預處理可高效地脫除木質素（超過80%）。雖然較高的堿用量可以加速木質素的分離，但后期堿處理壓力大，所以采用較低的堿用量，適當延長擠出后的保溫反應時間更經濟劃算。

圖3 不同預處理條件下纖維素和半纖維素的保留率及木質素脫除率

2.2.2 預處理后樣品的酶解評價 堿催化雙螺桿擠壓預處理后，小麥秸稈通過纖維素酶水解得到六碳糖與五碳糖的混合糖液可用于下游發酵工業生產生物能源和生物基化學品。圖4為不同預處理條件下纖維素與半纖維素酶水解48 h后的轉化率。相對于原生小麥秸稈和單純雙螺桿擠壓預處理后秸稈的酶解效果，堿催化雙螺桿擠壓預處理后，纖維素的酶解效果得到顯著改善。如圖4所示，隨著堿用量的提高，纖維素的轉化率大幅提高。例如，當堿用量由0.02 g/g干秸稈提高到0.1 g/g時，剛擠出的物料中纖維素的酶解轉化率由41.1%提高到了80.3%。TEP80型雙螺桿擠出機為高轉速擠出機，因此，物料在反應倉中停留的時間較短，進而后續的保溫反應可以使化學藥液與木質纖維素充分反應。保溫反應1 h在不同堿用量條件下，纖維素酶解轉化率都明顯提高， 特別是當堿用量為0.06 g/g時，保溫1 h后纖維素的轉化率由66.2%上升到87.7%。纖維素酶解轉化率與木質素的脫除率呈正相關，增大堿用量與延長保溫時間都有利于木質素的脫除，因此，纖維素的轉化率也會相應提高。但是，當保溫反應時間延長超過3 h時，木質素的脫除率不會發生太大變化（圖3），所以纖維素的轉化率也不會有較大提高。

圖4 預處理后纖維素與半纖維素的轉化率

由于螺桿擠壓解離纖維與堿催化脫除木質素的協同作用，剛擠出物料中半纖維素的轉化率也隨著堿用量的提高而提高。當堿用量低于0.08 g/g時，隨著保溫反應時間的延長，半纖維素的轉化率明顯提高；當堿用量大于等于0.08 g/g時，半纖維素的轉化率隨著保溫反應時間的延長不僅沒有明顯提高反而會下降，這主要是因為與纖維素相比，半纖維素的保留率受堿用量影響更大。因此，即使在較高堿用量條件下，剛擠出物料的半纖維素轉化率較高，但隨著保溫反應的進行，堿用量較低的物料也會達到理想效果。以酶解總糖得率和預處理經濟性為評價標準，當堿用量為0.06 g/g、保溫反應時間為1 h時，纖維素和半纖維素的水解率分別為87.7%和75.2%，總糖得率能達到83%。

2.3 預處理前后小麥秸稈的表征

掃描電鏡（SEM）可以有效提供小麥秸稈處理前后表面的結構信息。如圖5所示，堿催化雙螺桿擠壓預處理可以有效地解離纖維，使纖維變細，但并不能使纖維完全分離成單根纖維，這些結構上的變化主要是一級和少量的二級破碎［11］。但更重要的一點是，雙螺桿擠出機可以充當高效的混合器，使化學藥液充分滲透到纖維內部，從而改變木質纖維的化學組成及表面結構。因此，如圖5所示，原生小麥秸稈的表面結構光滑、致密，結構有序，嚴重阻礙了纖維素酶與纖維素的接觸。而采用0.02 g/g堿催化反應時，纖維表面開始變得粗糙和松動，但其表面依然覆蓋了大量木質素。當堿用量提高到0.06 g/g時，纖維素的結構基本暴露出來，并且變得粗糙無規則。因此，堿用量為0.06 g/g時，纖維素能夠取得更好的酶解效果。

由于纖維素大分子中存在大量羥基，使得纖維素分子的分子內和分子間存在大量氫鍵。纖維素的聚集態結構是由結晶區和無定形區交錯鏈接形成的。通過X射線衍射可以測定纖維素的結晶結構，了解堿催化雙螺桿擠壓預處理過程中秸稈中的纖維素結晶結構的變化。預處理前后小麥秸稈的X射線衍射圖如圖6所示，纖維素的結晶結構并未發生變化，依然呈現Ⅰ型纖維素結構。當采用較低堿濃度（0.02 g/g）預處理后，小麥秸稈的結晶度（CI）未發生明顯變化，由46.6%上升到48.6%；當采用0.06 g/g堿預處理時，秸稈結晶度明顯提高到57.9%。通常來講，植物原料的結晶度受原料化學組成的影響，主要與纖維素的相對含量有關。預處理后秸稈的結晶度提高，可能是與大部分的木質素、部分半纖維素和少量無定型纖維素的分離脫除相關。雖然雙螺桿擠壓處理可以解離纖維素，但并沒有改變纖維素的微晶結構，所以雙螺桿擠壓處理只能提高纖維素比表面積，并且增強木質素的分離。通過BET測試，對比原生小麥秸稈與0.06 g/g堿催化螺桿擠壓預處理后的秸稈發現，比表面積由1.05提高到了1.91 m2/g，孔容由0.0048 增加至0.0082 cm3/g。因此，小麥秸稈表面結構（比表面積、孔體積、孔徑分布）的變化，更有利于纖維素酶與纖維素的接觸，從而提高酶解得糖率［12-13］。

圖5 預處理前后秸稈的電鏡照片

圖6 預處理前后秸稈XRD和紅外圖譜

圖6為處理前后小麥秸稈的紅外表征圖。3300 ~3400 cm-1代表纖維素、半纖維素和木質素中羥基（-OH）的吸收峰，2900 cm-1為甲基和亞甲基中的C-H鍵的吸收峰。圖6中1504 cm-1為木質素芳香環骨架的吸收峰，預處理后其強度降低，說明木質素在預處理后的秸稈中含量降低，且隨著堿用量的提高使其信號強度減弱。1160 cm-1、1030 cm-1與895 cm-1分別代表纖維素中C-O-C、第一和第二的C-O-H與β-1，4-糖苷鍵的吸收峰，相對于原生秸稈預處理后秸稈吸收強度的增強，說明纖維素的含量明顯上升。紅外表征的結果與圖5一致。

2.4 提取的木質素的結構表征

如上文所述，獲得高質量的木質素，開發其潛在的應用價值已經成為生物能源開發利用的戰略支撐點，而且已經受到廣泛關注，因此，對木質素物理結構的研究就顯得至關重要。由于酶解木質素被譽為最接近天然木質素的工業木質素［14］，因此，本文選取酶解木質素作為對比進行分析。

通過二維核磁（HSQC）對酶解木質素和螺桿抽提堿木質素的結構進行進一步解析。圖7和表2為二維核磁的分析圖譜及具體的信號坐標。木質素的二維核磁信號通常分為側鏈區（δC/δH50~90/2.5~6.0）和芳環區（δC/δH100~150/5.0~ 8.5）。木質素的主要結構單元（G、S、H）和各種結構單元的鏈接鍵（β-O-4’、β-5’、α-O-4’等）都可以通過二維核磁進行表征。如圖7所示，在木質素的側鏈區，甲氧基為主要信號峰（δC/δH55.58/3.75）。β-O-4’結構為木質素的主要連接結構，主要是因為一年生草本植物生長過程中木質素難于生成碳碳鍵結構。堿催化雙螺桿擠壓預處理提取的木質素側鏈區存在木聚糖的信號，說明預處理脫木質素的過程中會伴隨少量半纖維素的降解。

在HSQC的芳環區，愈創木基（G）、紫丁香基（S）和對羥苯基（H）的信號都清晰可見。此外，還存在α位氧化的紫丁香結構（S’）、對香豆酸（pCA）結構和阿魏酸（FA）結構。S結構的C2，6-H2，6相關信 號 出 現 在δC/δH103.67/6.69 ppm，而S’的C2，6-H2，6相關信號卻出現在δC/δH104.67/7.31 ppm，但是在酶解木質素中未出現S’結構，可能是因為纖維素酶在酶解過程中會破壞S’結構。G結構單元的C2-H2、C5-H5、C6-H6的相關信號分別出現在δC/δH110.85/6.98、δC/δH115.45/6.77、δC/δH118.76/6.80 ppm。H結 構 的C2，6-H2，6相 關 信 號 出現 在δC/δH127.40/7.21 ppm。但 是，H結 構 的C3，5-H3，5相關信號并不明顯，主要是因為與G結構的C5-H5相關信 號重疊［3］。pCA的C2，6-H2，6、C3，5-H3，5分別出現在δC/δH129.94/7.56、δC/δH114.86/6.66 ppm，并且C3，5-H3，5與G結構的信號有部分重疊。通過二維核磁半定量分析發現，螺桿抽提堿木質素中H單元比例明顯下降且S/G比例明顯增大，說明木質素分離過程中H單元和G單元更易從木質素大分子中斷裂。pCA的Cα-Hα、Cβ-Hβ出現在δC/δH144.18/7.51、δC/δH114.07/6.36 ppm。FA的主要結構同樣被標定出，C2-H2、C6-H6、Cβ-Hβ分別出現在δC/δH116.40/6.37、δC/δH122.12/7.10、δC/δH116.40/6.37 ppm。通過核磁對木質素結構單元進行定量分析發現，H、pCA和FA單元結構所占比例明顯下降，可能是因為堿水解了阿魏酸、香豆酸與木質素之間的酯鍵，導致了木質素大分子結構上部分H單元結構的損失。從圖7還能發現不飽和脂肪酸U的結構信號為δC/δH129.38/5.31 ppm。

圖7 酶解木質素和堿木質素二維核磁圖

2.5 物料衡算與不同預處理手段能量輸入對比

圖8為在最優條件下進行預處理實驗的物料衡算及與常規預處理方法能量輸入對比。采用的預處理條件為：堿催化劑用量為0.06 g/g干小麥秸稈，保溫反應時間為1 h。反應后擠出黑液，清洗固渣后再擠出黑液，對固渣進行酶解。合并濃縮黑液，然后噴霧干燥濃縮黑液得到木質素。從1 t小麥秸稈中，能得到342 kg六碳糖和173 kg五碳糖，總糖得率能達到83%，得到的木質素純度大約為72%。目前，已經有多種預處理方式應用于工業或中式生產并且各有優劣，但是預處理過程中都會涉及能量的輸入（電能、熱能等）。通過對比機械研磨（球磨、盤磨）［15］、蒸汽爆破［16］、高溫水蒸煮［17］、高溫堿蒸煮［18］、亞硫酸鹽蒸煮—盤磨［19］等預處理手段的噸能量輸入，堿催化雙螺桿擠壓能量輸入最低（僅靠電能無需外部熱能輸入）。因此，堿催化雙螺桿擠壓對用于木質素纖維素類生物質預處理組分分離有良好的前景技術手段。

表2 木質素13C-1H相關的二維HSQC核磁的譜圖信號歸屬

3 結論

本文通過堿催化雙螺桿動態擠壓預處理技術進行了中試水平小麥秸稈預處理實驗，考察了螺旋組合中最小螺旋開口對解離纖維和酶解制糖的效果。從能耗與得糖率的角度進行了分析和評價，當螺旋最小開口為8 mm時，效果最優。堿性催化劑可以有效提高雙螺桿動態擠壓預處理后秸稈的酶解效率，因為堿性催化劑可以加速木質素的降解溶出，降低木質素對纖維素酶的無效吸附作用。當堿用量為0.06 g/g干秸稈、保溫時間為1 h時，總得糖率最高，超過80%。通過對分離提取的木質素進行結構表征發現，其化學結構保留良好，僅有部分木質素結構中的酯鍵水解，少量H結構單元與G結構單元降解。主要因為堿催化雙螺桿動態擠壓預處理秸稈過程中未進行高溫加熱，堿性降解程度較低，所以這種木質素更易于后期高值化利用。通過對不同預處理方式的能量輸入及預處理效果進行對比發現，堿催化雙螺桿動態擠壓技術預處理木質素纖維素類生物質具有很好的應用前景。

圖8 堿催化雙螺桿擠壓預處理物料衡算與能量輸入對比