基于Plackett-Burman和Box-Behnken設計優化超聲誘導防風種子發芽方法

李占君 劉運偉 王洪學 王巖 房柱 興成彬

摘 要：為研究一種超聲誘導促進防風種子發芽的方法，本文以超聲時間、超聲功率、水浴溫度、超聲頻率以及浸種時間展開單因素影響實驗。在單因素實驗的基礎上運用PBD（Plackett-Burman Design）進行關鍵因素的篩選，通過爬坡實驗得出關鍵因素的中心點。結合BBD（Box-Behnken Design）響應面優化關鍵因素條件，最終得出最佳超聲誘導防風種子發芽因素為：超聲時間16 min、超聲功率62 W、水浴溫度 35 ℃、超聲頻率40 Hz和浸種時間2 d， 且預期發芽率和預期發生概率分別為68.21%和98.70%。該條件下防風種子發芽率為65.66%，其相對誤差為3.74%。最佳超聲誘導條件實驗組與空白組相比，其發芽率、發芽勢和發芽指數均優于空白組，且發芽率最終提升了29.71%。超聲誘導處理與空白組種皮掃描電鏡結果得知，種皮條紋裂隙阻塞程度與通透性會因超聲過程中所產生的“空化效應”的作用得到較大程度的改善。研究表明適宜超聲誘導處理對防風種子的萌發具有積極促進作用。

關鍵詞：PBD;BBD;超聲誘導;防風種子;發芽率;種皮微觀結構

中圖分類號：S723.1+31.1;S718.3?? 文獻標識碼：A? 文章編號：1006-8023（2022）01-0076-10

Optimization of Ultrasonic Induced Germination of Saposhnikovia divaricate

Seeds Based on Plackett-Burman and Box-Behnken Design

LI Zhanjun1， LIU Yunwei1， WANG Hongxue1， WANG Yan2， FANG Zhu1， XING Chengbin1

（1.Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry， Yichun 153000， China;

2.Heilongjiang Academy of Forestry， Harbin 150081， China）

Abstract：In order to study a method of promoting seed germination of Saposhnikovia divaricate seed by ultrasonic induction， in this article， single factor experiments were carried out based on ultrasonic time， ultrasonic power， water bath temperature， ultrasonic frequency and seed soaking time. Based on the single factor experiment， Plackett-Burman Design （PBD） was used to screen the key factors， and the central point of the key factors was obtained through the climbing experiment. Optimize key factors and conditions in combination with Box-Behnken Design （BBD） response surface， the best ultrasonic-induced seed germination factors of the Saposhnikovia divaricata seed were： ultrasonic time 16 min， ultrasonic power 62 W， water bath temperature 35 ℃， ultrasonic frequency 40 Hz， seed soaking time 2 d， and the expected germination rate and expected occurrence probability were 68.21% and 98.70%， respectively. Under this condition， the germination rate of Saposhnikovia divaricate seed was 65.66%， the relative error was 3.74%. Compared with the CK group， the germination rate， germination potential and germination index of the experimental group were better than those of the CK group， and the germination rate was finally increased by 29.71%. The results of ultrasonic induction treatment and scanning electron microscope of CK seed coat showed that the blockage degree and permeability of seed coat stripe cracks could be greatly improved by "cavitation effect" produced in the process of ultrasound. Research showed that ultrasonic treatment had a positive effect on Saposhnikovia divaricate seed germination.

Keywords：PBD; BBD; ultrasonic induction; Saposhnikovia divaricate seed; germination rate; seed coat microstructure

0 引言

中草藥防風（Saposhnikovia divaricata （Trucz.） Schischk）為傘形科，防風屬，多年生草本植物[1-2]。我國古代人們很早就應用防風治療一些病癥，具有久遠的發展史，其自身對外界生存環境具有較強的適應能力，主要分布于我國的北方平原和半山區[3]。防風植株根部含有大量的藥用活性成分，現階段經有效分離鑒定出的有活性成分有100余種，其中代表性活性成分包括：有機酸、色原酮、香豆素、甘露類以及淄醇類化合物等[4- 5]。醫藥領域主要以未抽花植株的干燥根入藥，進行病癥的治療[6]。

相關研究表明，防風中所含有效活性成分具有較好的抗氧化能力，是一種天然性抗氧化劑，在食品、制藥領域扮演重要的角色，同時也被作為大宗藥材廣泛應用于抗腫瘤、鎮痛、抑菌以及解熱等多種病癥，具有重要的作用和意義[7-8]。由于防風藥用價值較高，而藥用防風主要以野生防風為主，致使防風藥用資源被過度的開發與應用，而防風種子主要通過收集野生防風種子的形式獲得，致使現階段我國野生防風資源遭受嚴重破壞，野生防風資源儲備已遠不能滿足中醫藥領域的需求[9-10]。國內外相關研究人員，對防風藥用資源現狀以及人工培育已展開的工作進行了研究和探討，其人工培育方式有：種子直播、幼苗移栽和根段營養繁殖等[11-12]。防風中有效活性成分會因人工培育方式的不同而有顯著性差異，目前種子培育過程中常規方式為直播培育[13]。由于東北防風自身生理原因，種子內部種胚需要經過后熟作用才能進行育種，此過程對防風的人工育種帶來了不可避免的限制和影響，因此防風的人工育種方法急需優化、改進。適宜的超聲對種子萌發具有積極促進作用，而現階段國內未見超聲誘導防風種子萌發相關性研究報道，種子發芽的研究主要集中在單純性單因素處理，較為簡單、系統性不強，未能對各影響因素進行互擾、線性工藝的優化。應用PBD （Plackett-Burman Design）可對各影響因素分析，篩選出主要關鍵性影響因素;結合BBD（Box-Behnken Design）對篩選得出的主要關鍵性因素予以回歸方程的擬合、分析，通過優化得到最佳影響參數。

本實驗主要研究超聲波刺激誘導防風種子的發芽的方法，對影響種子發芽的影響因素進行分析與研究。實驗過程中，以超聲時間（min）、超聲功率（W）、超聲水浴溫度（℃）、超聲頻率（Hz）和浸種時間（d）為單因素實驗;對單因素實驗數據進行了PBD分析;根據Pareto chart和各影響因素的貢獻率篩選出3個關鍵因素：超聲時間（min）、超聲功率（W）和超聲水浴溫度（℃） 。對這3個關鍵因素進行BBD優化，最終得出超聲誘導防風種子發芽的因素參數。對最佳超聲條件下的防風種子指標系數進行了測定。應用掃描電鏡（SEM）對超聲誘導處理前、后的防風種皮微觀結構進行鏡檢對比與分析。研究成果能為防風種子及其他植物種子的人工育種提供科學的理論和實驗性參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

優等東北防風種子，2019年9月采收于內蒙古海拉爾;脫脂棉、培養皿、濾紙、鑷子、解剖剪、無水乙醇、超純水、4%次氯酸鈉溶液等。

1.2 儀器

恒溫培養箱（MJ-500-11，上海一恒科技有限公司）;臺式數控超聲波清洗器（KQ-100DE，昆山市超聲儀器有限公司），凈化工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州廣源凈化科技有限公司）;超純水機（CMPL-TP-40L，成都優越科技有限公司）;理化干燥箱（LG100B，上海儀器總廠）;其他儀器玻璃器皿（天津化學玻璃儀器廠）;掃描電鏡（EVO 18，德國蔡司）等。

2 實驗方法

2.1 種子的處理實驗

預處理實驗：取適量防風種子，40 ℃溫水分別浸種0、1、2、3 d。

空白對照實驗（CK）：以40 ℃溫水浸泡1 d的種子為研究對象，75 %乙醇溶液浸泡20 s，同時滅菌純水沖洗3次;再配合4% NaClO溶液浸泡1 min，滅菌純水沖洗3次，50粒/組置于9 cm培養皿中（1.5%脂、水培養基做床），置于恒溫培養箱中25 ℃，相對濕度 60%暗培養，24 h后開始記錄，記錄頻率為24 h/次。

超聲誘導實驗：取適量經預處理的防風種子，置于5 cm×10 cm加厚自封袋（袋中以滅菌水為超聲傳輸介質浸泡種子）做超聲誘導處理。待超聲誘導處理完畢，再以75%乙醇溶液浸泡20 s，同時滅菌純水沖洗3次;再配合4% NaClO溶液浸泡1 min，滅菌純水沖洗3次，50粒/組置于9 cm培養皿中（1.5%瓊脂、水培養基），置于恒溫培養箱中25 ℃，相對濕度 70 %暗培養，24 h后開始記錄，記錄頻率為24 h/次，連續3 d無發芽視為實驗終止。

2.2 單因素分析

2.2.1 超聲時間

溫水浸種1 d （40 ℃），再將種子浸泡于滅菌水介質中，超聲功率80 W，超聲水浴溫度40 ℃，超聲頻率40 Hz，研究不同超聲時間5、10、15、20、25 min對種子發芽率的影響。

2.2.2 超聲功率

溫水浸種1 d （40 ℃），再將種子浸泡于滅菌水介質中，超聲時間15 min，超聲水浴溫度40 ℃，超聲頻率40 Hz，研究不同超聲功率40、60、80、100 W對種子發芽率的影響。

2.2.3 超聲水浴溫度

溫水浸種1 d （40 ℃），再將種子浸泡于滅菌水中，超聲時間15 min，超聲功率80 W，超聲頻率40 Hz，研究不同超聲水浴溫度30、35、40、45、50 ℃對種子發芽率的影響。

2.2.4 浸種時間

種子浸泡于滅菌水介質中，超聲時間15 min，超聲功率80 W，超聲水浴溫度40 ℃，超聲頻率40 Hz，研究不同浸種時間0、1、2、3 d對種子發芽率的影響。

2.2.5 超聲頻率

溫水浸種1 d （40 ℃），再將種子浸泡于滅菌水介質中，超聲時間15 min，超聲功率80 W，超聲水浴溫度40 ℃，研究不同超聲頻率40、60、80、100 Hz對種子發芽率的影響。

2.3 PBD 析因實驗

以單因素實驗為基礎，防風種子發芽率為響應值，對超聲時間、超聲功率、水浴溫度、超聲頻率和浸種時間這5個因素進行分析和評價，PBD析因實驗共12組，其因素水平見表1。

2.4 實驗優化

結合BBD對PBD實驗篩選出的關鍵性影響因素進一步進行響應面的三因素三水平的優化和分析。

2.5 防風種子相關播種指標的測定

千粒質量（g）采用電子天平稱取。

發芽率=（發芽總數/供試種子數）×100%。

發芽勢=（7 d內發芽總數max/供試種子數）×100%。

發芽指數（Gi） = Σ Gt /Dt （Gt 為浸種t 后天的發芽數，Dt為相應的發芽天數）[14]。

2.6 微觀結構對比與分析

為了能夠更好地對比超聲預處理和空白（CK）種子之間的差異，用掃描電鏡（SEM）觀察了防風種皮空間的微觀結構。10 μm導電金濺射膜分別涂于樣品表面，5.0 kV加速電壓高真空環境下鏡檢。

2.7 數據處理

在研究過程中，所得實驗數據均取實際數據的算術平均值±標準偏差。運用Origin 9.0軟件處理單因素實驗折線圖，其中PBD因素篩選實驗和BBD優化實驗均通過Design Expert 8.0.6軟件得以實現。

3 結果與分析

3.1 單因素影響實驗

3.1.1 超聲時間

在一定范圍內超聲時間對防風種子的發芽率具有一定程度的影響，如圖1（a）所示。當超聲時間不足20 min時，防風種子的發芽率會因超聲時間的增加而得到較大程度的提升;當超聲時間為20 min時，此時防風種子發芽率最高;當時間在20～25 min時，防風種子的發芽率開始變小。這主要因為，防風種子內部質膜會因超聲時間過長而受到不可逆轉的損傷，超聲時間過長對發芽起到抑制性作用[15]。因此以超聲時間10～20 min進行分析優化。

3.1.2 超聲功率

由圖1（b）可知，適宜的超聲功率對防風種子的發芽率具有一定程度的促進作用。當超聲功率低于80 W時，防風種子的發芽率會因超聲功率的加強而得到較大程度的提升;當超聲功率為80 W時，此時防風種子發芽率最高;當處理功率在 80～100 W時，防風種子的發芽率開始有走低的現象發生。主要原因在于，高強度的超聲作用會使得防風種子內部質膜受到非逆轉性的損傷，高強度超聲作用對發芽起到抑制性作用[16-17]。選擇40～80 W范圍進行下步優化。

3.1.3 超聲水浴溫度

由圖1（c）分析得出，適宜的超聲水浴溫度可以促進防風種子的發芽。當超聲水浴溫度低于40 ℃時，防風種子的發芽率會因超聲水浴溫度的升高而得到較大程度的提升;當超聲水浴溫度為40 ℃時，此時防風種子發芽率的提升幅度最大;當水浴溫度在 40～50 ℃時，種子的發芽率開始有降低的趨勢發生。主要原因在于適宜的超聲水浴溫度，有利于提高防風種子自身的持水性，種子活性得到加強，進而種子的發芽率會得到提升[17]。因此以30～40 ℃范圍進行工藝的優化研究。

3.1.4 超聲頻率

超聲頻率對防風種子的發芽特性具有顯著的影響，適宜的超聲頻率對防風種子有助于發芽。由圖1（d）可知，當超聲頻率低于40 Hz時，防風種子的發芽率會因超聲頻率的增加而呈遞增的趨勢;其中以超聲頻率為40 Hz時，防風種子的發芽率處于最佳值;當超聲頻率為40～100 Hz時，防風種子在該頻率范圍影響的情況下，會因超聲頻率過高而呈遞減的趨勢。主要原因在于，防風種子會因超聲頻率過高，其內部結構會受到永久性損傷;適當低頻范圍內超聲處理對防風種子的發芽具有一定程度促進效應，反之頻率過高會變為抑制[18]。因此以頻率20～40 Hz進行工藝的優化研究。

3.1.5 浸種時間

浸種時間對防風種子的發芽特性影響顯著，適當的浸種有利于種子的發芽。由圖1（e）可知，當浸種時間少于2 d時，防風種子的發芽率會因浸種時間的延長而呈遞增的趨勢;其中以浸種時間為2 d時，防風種子的發芽率處于最佳值;當浸種時間為2～3 d范圍時，防風種子會因浸種時間過長而呈遞減的趨勢。原因在于，適宜的浸種處理可以與所浸溶液進行物質循環，會使得溶液中對植物生長調節和營養消耗有幫助作用的物質（無機鹽離子、小分子物質）通過滲透作用進入種子內部，最終影響植物種子的發芽及各項生理代謝活動[19]。因此以浸種1～2 d區間進行工藝的優化研究。

3.2 PBD關鍵因素的篩選

PBD實驗是對研究過程中各影響因素進行高低兩水平設計，通過對比分析兩水平因素存在的差異與實驗整體差異二者之間的關系，進而實現判定因素的顯著性，最終能夠快速、有效地完成影響因素的篩選[20-21]。因此，在單因素實驗數據的基礎上，對超聲時間（X1，min）、超聲功率（X2，W）、水浴溫度（X3，℃）、超聲頻率（X4，Hz）和浸種時間（X5，d）進行PBD關鍵因素篩選，PBD編碼、實驗值、方差分析（ANOVA）、貢獻率和擬合統計見表1—表4。

由表3、表4和圖2分析可知，根據各影響因素所對應F分布可以得出影響防風種子發芽率因素影響程度由大到小依次為：X1、X2、X3、X4、X5。其中，X1 （P < 0.01）對防風種子發芽率影響表現為差異性極顯著;X2、X3 （0.01<P<0.05）為差異性顯著。篩選出關鍵因素X1 、X2 、X3 ，進行BBD響應面的設計、優化和分析。R2=0.912 1、調整 R2 =0.838 9篩選擬合和線性程度高，預測值為91.21%，矯正系數為83.89%。為了能夠更好地完成實驗，將X4和X5分別定值為40 Hz和2 d（圖2中T值為對應T檢驗值）。

3.4 關鍵因素的優化

優化實驗對應BBD編碼、實驗值、方差分析（ANOVA）和擬合統計見表5—表8。

應用響應面Design-Expert V 8.0.6 （State East），遵循Box-Behnken原則，對表5中3影響因素超聲時間（min）、功率（W）、水浴溫度（℃）進行優化。實驗方案經過模型擬合、優化，最終得出對應回歸方程：

Y =+67.92+1.77X1+0.68X2+0.43X3-0.53X1X2+0.55X1X3+0.38X2X3-3.21X12-2.64X22-5.95X32

對表7回歸方程方差數據分析，影響響應值Y的影響因素為：X1、X2、X3，X1X2、X1X3、X2X3，X12、X22、X32。通過F可以判定各類型影響因素的影響程度，其中非組合性和組合性影響因素的影響程度分別為：X1>X2>X3，X1X3>X1X2>X2X3和X32>X12>X22;其中，X1、X12、X22、X32表現為差異性極顯著（P<0.01），X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3為不顯著（P>0.05）。失擬項差異性不顯著（P>0.05），由此可以證實該組優化實驗的模型具有較高的擬合度，吻合性好。

R2 = 0.955 3、調整 R2 = 0.897 9說明優化實驗擬合模型的擬合和線性程度高，其預測值可達95.53%，矯正系數為89.79%。

圖3為關鍵因素RSM設計和優化所對應的3D傘狀圖，通過分析3D傘狀圖可以確定優化關鍵因素的極值（最大、最小值）和中間值;下方2D平面等高線圖能夠在二維成像基礎上呈現三維關系，可以起到確定預期響應水平變量的作用，進而確切、直觀反映被優化因素對響應值Y（發芽率）的影響強度[20-21]。在優化實驗數據基礎上，以響應值Y為Z軸，其他2個因素分別為X軸和Y軸擬合建立模型，分析和研究3D傘狀圖時以其中一因素設定為定值0。

對圖3（a）分析可知，在一定區間范圍內防風種子的發芽率會因影響因素X1和X2的提升而得到相應程度的提高，當發芽率達到最大值后伴有走低現象發生，同時因素X1、X2之間交互作用為差異性不顯著（P>0.05）。X1為16 min，X2為62 W，此時防風種子發芽率對應響應值增量（Δ）狀態最佳。

同理，對圖3（b）、圖3（c）因素X1X3和X2X3分析，可以得出防風種子發芽率對應響應值增量（Δ）狀態最佳時條件分別為：X1X3（16 min，35 ℃），X2X3（62 W，35 ℃），且X1、X3和X2、X3均為差異性不顯著（P>0.05）。以3D傘狀圖與縱軸的坡度（傾斜程度），可以得出組合影響因素X1X2、X1X3和X2X3中各因素影響程度，X1>X2，X1>X3， X2>X3，最終X1>X2>X3，與表7分析結果吻合。

3.5 工藝驗證性實驗

應用Origin 9.0和Design Expert 8.0.6軟件對實驗數據系統性地處理、分析與研究，最終響應面擬合優化得出影響防風發芽各因素的最佳參數：超聲時間16 min、超聲功率62 W、水浴溫度 35 ℃、超聲頻率40 Hz和浸種時間2 d，預期發芽率為68.21%，預期發生概率為98.70%。最終得出發芽率的算術平均值為65.66%，相對誤差為3.74%，說明優化實驗成立，數據有效。

3.6 防風種子相關播種指標

表9分析可知，最佳超聲誘導條件實驗組與空白組相比，其發芽率、發芽勢和發芽指數均優于空白組，且發芽率最終提升了29.71%。說明適宜超聲誘導處理對防風種子的萌發具有積極促進作用。

3.7 防風種皮微觀結構對比與分析

超聲處理防風種子過程中，種子的種皮結構發生了一系列變化。圖4為10.0、15.0 k倍數情況下空白對照和超聲誘導處理后種皮微觀結構的掃描電鏡對比分析圖。由空白未處理的防風種皮掃描電鏡圖4（a）觀察可知，未經超聲處理情況下防風種皮較厚，種皮表面條紋裂隙被種皮分泌的揮發油性等物質填充（阻塞）[22]。種皮通透性不佳將會抑制種子生物活性，不利于種子自身與外界環境之間的物質循環、能量流動以及信息的傳遞（水分、空氣、光照、溫度）等，進而不利于種子的萌發。

當防風種子經過超聲誘導處理后，圖4（b）種皮條紋裂隙阻塞程度會因超聲過程中所產生的“空穴效應”的作用得到較大程度的改善，進而種皮通透性得到改善。防風種子內有效物質（蛋白質、酶類）的生物活性會得到一定程度的提高，種子內部與外界環境之間的物質循環、能量流動以及信息的傳遞（水分、空氣、光照、溫度）等相應得到改善，因此適當的超聲作用對防風種子的萌發具有積極促進的作用[23]。

4 結論與討論

本研究以單因素實驗為基礎，采用PBD法對防風發芽的影響因素：超聲時間、超聲功率、水浴溫度、超聲頻率以及浸種時間進行關鍵因素的篩選，得出關鍵因素超聲時間、超聲功率、水浴溫度。再以關鍵因素中心點展開BBD設計和優化，最終優化得出最佳影響因素條件為：超聲時間16 min、超聲功率62 W、水浴溫度 35 ℃、超聲頻率40 Hz和浸種時間2 d， 且預期發芽率和預期發生概率分別為68.21%和98.70%，該條件下防風種子發芽率為65.66%，相對誤差為3.74%。

此外，又對防風種子相關播種指標（最佳超聲條件組和空白組）進行了測定，得出超聲誘導處理過的發芽率、發芽勢和發芽指數均高于空白組，且發芽率最終提升了29.71%，說明適宜條件的超聲誘導對防風種子的萌發具有積極促進作用。運用掃描電鏡對最佳超聲處理組電鏡對空白組的防風種皮微觀結構予以初步對比和分析，發現超聲處理后的種皮的條紋裂隙阻塞、通透程度均得到較大程度改善，因此有利于種子內部與外界環境之間的物質循環、能量流動和信息的傳遞。進一步說明適當的超聲作用對防風種子的萌發具有積極促進的作用。

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