藏西北白絨山羊大腸桿菌的分離鑒定及其耐藥性初探

平 措，達娃普赤，丹 增，達 瓦，次仁羅措，德 吉

（1.西藏自治區措勤縣紫絨山羊原種場，西藏 措勤 859300；2.西藏自治區尼瑪縣白絨山羊原種場，西藏 尼瑪；3.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩）

大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli），俗稱大腸桿菌，多數是溫血動物腸道內正常菌群成員。動物出生后數小時即可經口進入消化道后段定居，終生伴隨并經糞便不斷散播于周圍環境。大腸桿菌大小為0.1~0.7 μm × 2~3 μm，顯微鏡下為兩端鈍圓，散在或成對存在的革蘭氏陰性無芽胞的直桿菌。本菌為兼性厭氧菌，在普通培養基上生長良好，最適生長溫度為37 ℃，最適生長pH 為7.2~7.4。麥康凱瓊脂上形成紅色菌落；在伊紅美藍瓊脂上產生黑色帶金屬閃光的菌落[1]。

羊的大腸桿菌病可分為成年羊的大腸桿菌病和羔羊的大腸桿菌病[2]。其中，成年羊大腸桿菌病主要表現為母羊乳房炎，羔羊大腸桿菌病則以敗血癥和腹瀉為主要臨床特征，發病急、致死率高，嚴重威脅泌乳母羊和羔羊的健康[3]。此外，大腸桿菌也是引起不同時期羊呼吸道疾病的病原之一，引起流淚、體溫升高、精神沉郁等癥狀[4]。本試驗通過對15 只藏西北白絨山羊腹瀉羔羊的糞便樣品進行細菌分離培養，確定其病原為大腸桿菌。隨后，對菌株進行生化試驗及藥物敏感性試驗，并對其耐藥性進行檢測，以期為今后藏西北絨山羊的大腸桿菌耐藥性研究及防治工作提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 腹瀉羔羊糞便樣品采自15 只藏西北白絨山羊腹瀉羔羊。其中，西藏自治區尼瑪縣某白絨山羊場10 只，措勤縣紫絨山羊原種場5 只。樣品采集后運送至實驗室進行診斷。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺購自濟南鑫貝西生物科技有限公司，電熱恒溫培養箱購自上海躍進醫療器械廠，生物顯微鏡購自重慶重光實業有限公司。

1.1.3 主要試劑 麥康凱瓊脂、M-H 瓊脂均購自青島海博生物技術有限公司，細菌革蘭氏染液購自北京索萊寶科技有限公司，細菌生化鑒定管購自杭州濱河微生物試劑有限公司，藥敏紙片根據歐盟藥敏試驗標準（EUCAST 2017）自行制作并保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離培養及純化 在超凈工作臺中將采集的糞便樣品接種于麥康凱瓊脂平板，36±1 ℃培養24 h，24 h 后挑取平板上單獨的粉紅色菌落再次接種于麥康凱平板，36±1 ℃ 培養24 h，得到純化的細菌進行后續試驗。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢 事先在無菌載玻片上滴一滴生理鹽水，用無菌接種環挑取少量已純化培養基上的單獨菌落至載玻片上，與生理鹽水混勻，用酒精燈火焰干燥固定。首先用結晶紫染液染色1 min，結束后用蒸餾水沖洗染液，之后使用碘液染色1 min，再用蒸餾水沖洗染液，之后使用酒精脫色15 s，然后用蒸餾水沖洗染液，最后用沙黃染液復染1 min，結束后用蒸餾水沖洗染液并用吸水紙將載玻片上殘留液體吸干，置于油鏡下觀察。

1.2.3 生化試驗 用接種針挑取已純化平板上的單獨菌落接種至生化鑒定培養基內，按照生化鑒定管說明書進行操作，36±1 ℃ 恒溫靜置培養，于24 ~ 48 h 內觀察結果。

1.2.4 藥敏試驗 按照歐盟藥敏試驗標準規定的紙片擴散法（2017 版）對已純化的分離菌進行藥敏試驗，使用細菌濁度儀調整菌液濃度至0.5 麥氏值，吸取50 μl 菌液均勻涂布于表面干燥的MH 瓊脂平板，貼附藥敏片后置于培養箱中36±1 ℃ 培養12 h 后觀察結果。

2 結果

2.1 細菌分離純化結果

經恒溫培養24 h 后麥康凱瓊脂平板上可見大小均一的粉紅色菌落，鏡檢可見兩端鈍圓，散在或成對存在的革蘭氏陰性桿菌（圖1）。

圖1 分離株平板及鏡檢形態

2.2 生化鑒定結果

根據細菌生化鑒定管結果判定說明書，判定記錄分離菌的生化試驗結果（表1）。將生化試驗結果與《伯杰細菌鑒定手冊》比對，結合菌落特征與鏡檢可確定分離株為大腸桿菌。

表1 分離菌生化試驗結果

2.3 藥敏試驗結果

根據美國臨床實驗室標準化委員會頒布的《抗微生物藥物敏感性實驗執行標準》判定藥敏試驗結果，結果顯示分離株對磺胺甲惡唑、諾氟沙星、阿奇霉素、氯霉素、四環素、環丙沙星敏感，對強力霉素、卡那霉素、多黏菌素、紅霉素中介，對桿菌肽、頭孢克肟、青霉素耐藥（表2）。

表2 大腸桿菌藥敏試驗結果

3 討論

白絨山羊產業已經成為藏西北地區農業發展和農牧民增收的重要產業，對區域經濟發展具有不可替代的重要作用。羔羊腹瀉一直是影響養羊業發展的重要疾病之一，產羔季節，如果飼養管理、產羔護理和疾病防控工作不到位，就可能引起羔羊大批發病[5]，嚴重影響羔羊正常生長發育。病毒、細菌及寄生蟲感染均有可能導致羔羊腹瀉[6]，其中，大腸桿菌是引起羔羊腹瀉的重要病原。大腸桿菌引起的羔羊腹瀉發病急、病程短、致死率較高，給養殖戶帶來較大經濟損失。此外，由于抗生素濫用導致的耐藥大腸桿菌不斷出現并傳播，不僅破壞動物體內微生態平衡，而且易流入人體，危害人類健康和食品衛生安全。

為調查藏西北腹瀉羔羊的發病原因，本試驗采集藏西北腹瀉羔羊糞便，經細菌分離培養及生化試驗檢測，確認其病原均為致病性大腸桿菌。由于不同地區的大腸桿菌分離株血清型不一樣，地區性特征明顯，加之不同血清型大腸桿菌之間缺乏有效的交叉免疫保護，從而給大腸桿菌病的有效防治增加了難度[3]。現階段針對大腸桿菌病的主要措施是加強飼養管理與環境衛生清潔，此外也可根據藥敏試驗的結果，適當使用對應敏感抗生素，并輔以補液治療[7]。本研究為今后藏西北絨山羊的大腸桿菌耐藥性研究及防治工作提供參考依據及臨床用藥指導。