運動馬糞樣微生物對黑麥草等幾種牧草的體外發酵研究

曹 允，張 潔

（北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京 102442）

運動馬因運動劇烈對飼料能量的要求比普通繁殖馬高很多。傳統運動馬飼料以谷物飼料為主，谷物飼料中的淀粉為其提供能量，但單一的谷物飼料存在很多不足。有研究評價指出[1]，谷物飼料中的淀粉會導致馬胃潰瘍，從而對馬匹的行為表現產生嚴重的不良影響，由相同比例的干草和谷物組成的日糧對斷奶生長馬的增重效果高于單純的谷物飼料。高谷物飼料也可能會導致高血糖、胰島素等一系列代謝問題。另有研究發現[2]，高強度運動期間，在運動馬日糧中添加高能量纖維飼料不會對糖原利用或肌肉乳酸清除產生不利影響，并且僅含干草料的飼料可以抵消高強度運動引起的酸中毒。干草、甜菜漿、大豆殼等高能纖維飼料能滿足賽馬等運動馬能量需求的能力。任萬路[3]等提出，將優質牧草喂給運動馬，在此基礎上適當降低谷物飼料的比例有利于運動馬的營養需求。由此可見，運動馬的飼料配比要兼顧谷物飼料和粗飼料的平衡使用以保障馬匹的健康和能量。

體外分析法是評定動物飼料營養價值的主要方法，借助生物學方法體外模擬動物消化過程估測飼料消化率，但體外法主要用于評定反芻動物飼料營養價值[4]，用體外發酵技術研究單胃動物飼料發酵特性的報道還較少，且主要集中在非淀粉多糖和寡糖的發酵特性研究。有學者改進了體外產氣法，并將其應用到豬營養研究中，該方法主要用豬盲腸內容物作為菌源，離心凍干的盲腸內容物作為發酵底物[5]。體外發酵模型具有操作簡單、經濟、快速等優點，是一種理想的研究單胃動物后腸發酵的模型[6]。腸道微生態學的發展使單胃動物的后腸發酵過程越來越受到關注。普遍認為，發酵過程和終產物對動物健康有重要影響。

馬腸道中寄生著大量的微生物菌群，這些微生物用來幫助分解粗飼料中的纖維，馬屬于后腸發酵動物，80 % 的纖維在其后腸中完成降解。這些微生物能以粗纖維為碳源，將粗纖維發酵成脂肪酸，供給宿主基本的能量需要[7]。本試驗以運動馬新鮮糞便為底物發酵黑麥草、菊苣和小麥草，通過纖維素和半纖維素含量的測定、發酵產氣性能、發酵產物等評估運動馬腸道微生物對不同草料粗纖維的利用，為牧草粗纖維作為運動馬飼料添加提供理論依據，同時也為體外發酵法研究單胃動物后腸發酵提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 草料纖維的制備 粗纖維草料選擇黑麥草、菊苣、小麥草干草。將干草剪成2～3cm 小段，粉碎過20 目篩（0.85 mm）作為發酵用草料備用。

1.1.2 運動馬糞樣的采集 糞樣采集于2021 年9月北京農業職業學院健康運動馬5 匹。采集新鮮的糞樣并迅速置于厭氧袋中，帶回實驗室后迅速放于厭氧箱中備用。

1.1.3 發酵接種底物的配制 在厭氧箱中取8 ml滅菌生理鹽水與2 g 糞樣進行混合，混勻后用無菌紗布過濾2 遍，去除糞樣中的殘渣，所得濾液為發酵接種底物。

1.1.4 無碳培養基的配制 無碳培養基能選擇利用特殊碳源的微生物，在此實驗中能保證馬糞樣微生物以粗纖維作為碳源進行體外發酵。具體成分如下表1[8]。

表1 無碳培養基成分

培養基使用之前新鮮配制，配制時按照下列比例和順序加入：蒸餾水（800 ml）+ A（0.2 ml）+ B（400 ml）+ C（400 ml）+ D（2 ml）+E（80 ml）。用CO2飽和后預熱至39 ℃。

1.2 方法

1.2.1 體外發酵實驗設計 按照表2 的發酵方案設計發酵組（發酵總體積為50 ml，發酵接種底物接種量占總體積的1 %，草料纖維添加量為1 %），每個發酵組設置5 組重復，將每個發酵組置于發酵瓶中于37℃培養箱中，發酵48 h。

表2 發酵組設計方案

1.2.2 發酵前后纖維素和半纖維素含量的測定取發酵前的干草1.00 g（40 目篩）及發酵后的發酵液50 ml，根據范式洗滌法[9]，經中性洗滌劑煮沸處理及酸性洗滌劑處理后，測定纖維素和半纖維素的含量。

1.2.3 發酵產氣量的測定 以50 ml 坐式發酵管測定不同發酵組 1 h、2 h、3 h、4 h、12 h、18 h、24 h、48 h 的產氣量，以發酵管中氣柱下降高度計為產氣量。

1.2.4 揮發性脂肪酸的測定 準確稱取1.00 g 發酵物（48 h），置于50 ml 離心管中，加入5 ml體積比1:1 的甲醇-水溶液（含0.2 % HCl），渦旋混勻1 min 后500 W 超聲波提取15 min，待溶液冷卻后8 000 r/min 離心5 min，取上清液通過0.22 μm 濾膜后以GC-MS 法[10-11]進行發酵物中6種揮發性脂肪酸的測定。

1.2.5 數據分析 所有數據經excel2003 初步整理計算后，采用spassv21.0 軟件進行統計學分析。數據以平均值±標準誤表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果

2.1 體外降解纖維性能

由表3 可知，3 種干草發酵前纖維素和半纖維素含量均有差異，纖維素和半纖維素含量為：黑麥草＞小麥草＞菊苣。各種干草與運動馬糞樣底物進行發酵后，干草中纖維素和半纖維的含量較發酵前均有顯著性下降（P＜0.05）。

表3 各干草纖維素和半纖維素發酵前后的含量 （%）

根據公式：纖維素或半纖維素降解率=（發酵前的纖維素或半纖維素總量-發酵后的纖維素或半纖維素總量）/發酵前的纖維素或半纖維素總量。

結果為：黑麥草、小麥草和菊苣纖維素平均降解率為11.13 %、12.22 %、30.94 %，半纖維素平均降解率為27.46 %、11.19 %、14.64 %，糞樣微生物對纖維素和半纖維素的降解率：菊苣＞黑麥草＞小麥草。

2.2 體外發酵產氣性能

運動馬糞樣微生物對不同干草發酵后產氣性能見表4。前4 h 發酵過程中，黑麥草、小麥草產氣量無顯著差異，菊苣與其他2 種干草相比，產氣性能顯著性提高（P＜0.05），表現為產氣速度與產氣量較其他2 種干草高。在發酵12~24 h中，黑麥草的產氣性能較其它干草顯著性差（P＜0.05），其它2 種干草無顯著性區別。到48 h終末，3 種干草的產氣總量無顯著差別（P＞0.05）。

表4 各發酵組產氣量 （ml）

2.3 發酵后揮發性脂肪酸（VFA）濃度

糞樣微生物發酵3 種干草后的發酵產物VFA種類及濃度見表5。由表5 可知，3 種干草經發酵后產生的乙酸濃度最高，顯著高于其它各類VFA（P＜0.05），又尤以菊苣產生的乙酸濃度最高，其次為小麥草和黑麥草。丙酸、正丁酸、異丁酸、異戊酸的濃度高低依次為菊苣＞小麥草＞黑麥草，且差異顯著（P＜0.05）。3 種干草產生的正戊酸濃度無顯著差異。菊苣產生的VFA 總濃度最高，其次為小麥草，黑麥草產生的VFA濃度最低。

表5 各發酵組產生揮發性脂肪酸種類及濃度 （μg/g）

3 討論

在傳統運動馬飼料中加入適量優質牧草，可以適當降低基礎谷物飼料的比例。本試驗利用運動馬糞樣微生物對包括黑麥草在內的3 種牧草干草進行體外發酵，結果表明：

（1）運動馬糞樣微生物對黑麥草、小麥草和菊苣中的纖維素和半纖維素有顯著降解能力，且對菊苣的降解能力最強，這種降解差異可能和糞樣微生物的組成和種類有關，也可能和牧草的形態、結構有關[12]。

（2）揮發性脂肪酸是厭氧消化過程的重要中間產物，對動物代謝有重要作用，對機體有許多調節功能[13]。微生物發酵干草后產生的VFA主要有乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，尤以產生乙酸為主。產生不同種類的VFA 可能與不同干草中的碳水化合物以及不同微生物的發酵性能相關。本試驗中，菊苣產生的VFA 總量最高，黑麥草產生的VFA 最低。

（3）微生物發酵干草的過程中會產生氣體，氣體包含微生物直接降解纖維產生的氣體以及腸道中某些菌與VFA 形成的氣體，通過測定產氣量可以進一步分析牧草干草粗纖維被降解數量與生成VFA 的量[14]。在本試驗中，發酵初始（4 h 內）菊苣的產氣性能包括產氣量和產氣速度都優于其它2 種干草，發酵結束時（48 h）3種干草的產氣量無顯著差異。提示在發酵初始階段（4 h 內），菊苣的纖維降解與產生的揮發性脂肪酸都優于其它2 種干草。

4 結論

在添加牧草飼料時，不僅要考慮牧草中粗蛋白（CP）的含量來保證牧草的營養價值，還要綜合考慮運動馬腸道微生物對纖維的降解能力，從對馬的腸道健康方面還要考慮產生的揮發性脂肪酸的含量。從纖維降解能力來看，在本試驗的3種牧草中，運動馬糞樣微生物在體外對菊苣的降解能力最強，對黑麥草降解能力最弱。從產生的揮發性脂肪酸來看，體外發酵中菊苣產生的VFA含量最高，黑麥草最低。從產氣性能看，菊苣在與糞樣微生物混合4 h 內，較其它2 種牧草能迅速發酵。在添加飼料時，綜合考量這些因素，菊苣為3 種牧草添加中利用率較好的一種品種。