地源性優勢青貯發酵乳酸菌的篩選與鑒定

王 誠，劉德娟，翟桂玉，牛 星，何榮彥，董桂紅，劉 雨，李 燕，王 玲，邢 燭，趙福平，鞏 倩，宗 倩，董曉桐

（1.山東健源生物科技有限公司，山東 泰安 271000；2.泰安市動物疫病預防控制中心，山東 泰安；3.山東省畜牧總站，山東 濟南；4.臨沂科技職業學院，山東 臨沂）

近年來，乳酸菌作為青貯飼料添加劑的研究越來越受到人們的重視，因為乳酸菌能夠使青貯飼料盡快進入乳酸發酵產生高濃度的乳酸，抑制腐敗菌的生長繁殖，提高青貯飼料的品質，提高營養價值，改善飼料適口性，促進動物采食量和生產性能。研究結果表明，乳酸菌對青貯飼料發酵起促進作用的主要因素，一是附著在青貯原料表面上的數量，二是乳酸菌的種群（質量），乳酸菌附著數量越多（當達到或超過105cfu/g 青貯原料鮮重時），乳酸菌株品質越優良（如植物乳桿菌、布氏乳桿菌等）就能制備獲得優質的青貯發酵飼料，而達到此目的有效方法就是在制作青貯飼料過程中可直接添加乳酸菌菌制劑。

該試驗緊密結合生產實際，在前期分離獲得的6 株不同地源乳酸菌的基礎上，采用多種先進的實驗技術，篩選鑒定得到了2 株青貯飼料發酵優勢乳酸菌，為后期研制高品質的青貯飼料添加劑奠定了堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

6 株地源性乳酸菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌菌種，均由健源生物科技有限公司提供；MRS、LB 培養基，購自青島陸橋生物試劑有限公司；16 SrDNA 引物，由青島生工合成；細菌基因組提取試劑盒、2xEsTaqMasterMix、瓊脂糖凝膠、聚合酶等，均購自生物工程（上海）有限公司；37 ℃ 恒溫培養箱、pH 酸度計、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀，由健源生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 產酸發酵效果試驗 將6 株地源性乳酸菌分別接種MRS 液體培養基，置于37 ℃ 恒溫培養箱培養36 h，期間每隔2 h 用酸度計分別測定各個菌種發酵液pH，檢測至36 h，記錄結果。

1.2.2 抑菌效果試驗 將6 株地源性乳酸菌分別接種MRS 液體培養基，37 ℃ 培養36 h，然后利用直徑6 mm 的濾紙片分別蘸取各乳酸菌培養液，分別均勻分布粘貼于涂有致病性大腸桿菌、沙門氏病原菌的LB 瓊脂平板上，37 ℃ 孵育24 h，觀察抑菌圈，用卡尺測量抑菌圈大小，記錄結果。

1.2.3 PCR 鑒定 通過細菌基因提取試劑盒對產酸和抑菌效能較好的2 株乳酸菌分別進行基因組提取，應用16 SrDNA 引物（F-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG 和 R-TACGGCTACCTTGT TACGACTT），通過聚合酶鏈式反應PCR 擴增方法進行擴增鑒定，再進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察記錄結果。

1.2.4 最適生長條件試驗 對篩選獲得的2 株產酸和抑菌效果較好的乳酸菌在不同溫度、不同pH、不同接菌量、不同培養時間下檢測其發酵后活菌數量，統計結果，建立較優發酵條件。實驗設計見表1。

表1 試驗設計

2 結果與分析

2.1 產酸試驗結果

6 株地源性乳酸菌的產酸結果見表2。

表2 乳酸菌產酸效果（pH）

由表2 結果顯示，有2 株乳酸菌（編號：T2和F1）培養4 h 內pH 下降最快，12 h 的pH 可降到4.0 以下，24 h 趨于平衡。

2.2 抑菌試驗結果

通過抑菌試驗，6 株地源性乳酸菌對致病性大腸桿菌、沙門氏菌的抑制效果見表3 和圖1。

表3 乳酸菌的抑菌效果（抑菌圈直徑：mm）

圖1 乳酸菌對病原菌的抑菌效果圖

由表3 和圖1 結果表明，6 株地源性乳酸菌中的F1 株和T2 株菌對致病菌的抑制效果最好，其他株乳酸菌的抑菌效果較差。

2.3 PCR 鑒定結果

提取F1 和T2 乳酸菌的目的基因組DNA后，利用細菌的通用引物通過 PCR 擴增出16srDNA 序列，經凝膠電泳，顯示1 508 bp 和1 500 bp 大小的條帶（見圖2）。將測序所得PCR 產物DNA 序列搜索GenBank 同源序列及基因比對結果顯示，F1 株與GenBank 中布氏乳桿菌（AB368914.1）99 % 同源；T2 株與GenBank中植物乳桿菌（NR115605.1）99.52 % 同源。因此，兩株乳酸菌分別是植物乳桿菌（F1 株）和布氏乳桿菌（T2 株）。

圖2 2 株乳酸菌16SrDNA 擴增圖

2.4 最適生長條件試驗結果

根據在不同溫度、不同pH、不同接種菌量、不同培養時間下兩株乳酸菌的生長后的活菌數量，F1 株的最佳組合為a2b4c3d2（即溫度為37 ℃，pH 為4.0，接菌量為2 %，發酵時間為36 h），T2 株為a1b3c3d2（即溫度為35 ℃，pH為6.0，接菌量為2 %，發酵時間為36 h），見表3 和表4。

表3 乳酸菌T2 菌株發酵條件優化結果

表4 乳酸菌F1 菌株發酵條件優化結果

3 討論與結論

青貯飼料是將含水分多的植物性飼料經切碎后密封，在厭氧的條件下通過乳酸菌的發酵產酸作用，抑制各種雜菌的繁殖而得到的一種粗飼料。青貯飼料具有營養豐富、氣味酸香、柔軟多汁、適口性好等特點，是反芻動物優良的飼料來源。另外，青貯飼料利于長期保存，可以解決冬季家畜缺少鮮飼料的問題,進而改善畜產品品質。

青貯飼料發酵過程中的微生物主要是乳酸菌，而乳酸菌的種質差異對青貯飼料的發酵品質至關重要。前期研究發現，乳酸菌添加劑在青貯過程中不僅可以產生大量的乳酸，降低青貯飼料的pH，其在發酵過程中對整個青貯飼料微生物組成產生深遠影響，并產生大量對家畜具有潛在健康益處的代謝產物。為了獲得優良的乳酸菌株，近年來國內外許多專家對青貯飼料用優質乳酸菌開展了分離鑒定篩選研究，許多研究成果有較大的參考應用價值。如宗亞倩等從青貯玉米中分離鑒定和篩選乳酸菌，為制作青貯飼料提供了優良菌種，對改善青貯飼料品質具有重要指導意義[1]；胡勇在自然發酵青貯玉米飼料中，通過16 SrRNA 通用引物進行PCR 擴增及測序鑒定布氏乳桿菌等乳酸菌[2]。席琳喬從青貯玉米中分離到10 株異型乳桿菌，并通過產酸和抑菌效果實驗證明分離菌株均是制作青貯飼料的優良菌株[3]。Mcdonald 等論述了青貯添加劑的乳酸菌菌種應具備繁殖速度快、競爭力強、耐酸程度高、產酸速度快（pH 降低快）且產酸量大等條件[4]；據報道，植物乳桿菌和布氏乳桿菌等可具備青貯添加劑乳酸菌菌種的條件。

本研究采用常規微生物學及分子生物學技術對前期分離自泰安、費縣、惠民、鄆城、諸城5個不同地域的6 株（編號：F1、F2、F3、T1、T2、T3 株）乳酸菌進行了篩選試驗，通過產酸、抑菌能力檢測，最終確定F1 和T2 株乳酸菌為優勢菌株。在此基礎上，對F1 和T2 株菌的最適生長條件進行了試驗，獲得了有價值的數據；另外通過PCR 鑒定，探明了菌株名稱，分別為布氏乳桿菌（F1 株）和植物乳桿菌（T2 株）。有研究結果發現，植物乳桿菌為同型發酵乳酸菌，布氏乳桿菌為異型發酵乳酸菌。同型發酵乳酸菌產酸量多、產酸速度快，異型乳酸菌發酵的終產物除乳酸外，還包括乙酸、乙醇等物質，這些代謝產物可有效抗御霉菌等生長繁殖，有效防止青貯飼料二次發酵及腐敗。在制作青貯飼料時，可將同型發酵乳酸菌和異型發酵乳酸菌同時使用，會充分發揮兩個菌作用的優勢。本試驗成功篩選到了植物乳桿菌和布氏乳桿菌，為研制優質青貯飼料乳酸菌添加劑奠定了堅實基礎。