污染土壤修復(fù)技術(shù)專利分析

文|白鴿

土壤是人類生產(chǎn)活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是不可缺少、難以再生的自然資源，其管理使用的好壞直接決定著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成敗和人類文明的興衰。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)、科技、工業(yè)、建筑的飛速發(fā)展和高強(qiáng)度的人類活動(dòng)，以及對后備土地的過度開發(fā)利用，可供使用的土壤資源日益緊張，土壤的流失和污染極為嚴(yán)重，已經(jīng)影響到可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略目標(biāo)。因此，對污染土壤進(jìn)行分析和修復(fù)勢在必行。本文調(diào)查研究了我國利用微生物修復(fù)污染土壤的專利申請概況，結(jié)合具體專利文獻(xiàn)對微生物修復(fù)專利技術(shù)進(jìn)行了介紹。微生物修復(fù)土壤污染是一種高效、經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保的生態(tài)修復(fù)技術(shù)。一方面，在降解、轉(zhuǎn)化及固定污染物的微生物篩選、廣譜性、高效性的研究工作還有待進(jìn)一步開展。另一方面，應(yīng)加強(qiáng)已有技術(shù)成果的轉(zhuǎn)化，有序促進(jìn)土壤修復(fù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，使基礎(chǔ)的理論研究用于指導(dǎo)實(shí)踐，發(fā)揮更大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

根據(jù)修復(fù)原理的不同，污染土壤修復(fù)可分為物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)三種類型。由于生物修復(fù)技術(shù)較物理、化學(xué)方法經(jīng)濟(jì)，不易產(chǎn)生二次污染，且具有低耗、高效、環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)，因而近幾年發(fā)展迅猛，已經(jīng)成為污染土壤修復(fù)技術(shù)最活躍的領(lǐng)域。根據(jù)污染土壤生物修復(fù)主體不同，生物修復(fù)技術(shù)進(jìn)一步分為微生物修復(fù)、植物修復(fù)和動(dòng)物修復(fù)，其中以微生物修復(fù)應(yīng)用最為廣泛。

1 土壤污染修復(fù)相關(guān)專利技術(shù)發(fā)展態(tài)勢

以專利數(shù)據(jù)庫作為數(shù)據(jù)采集來源，以關(guān)鍵詞（土壤、污染、微生物、修復(fù)）和分類號(hào)作為主要檢索要素，對2021年12月31日之前公開的專利文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，獲得中國發(fā)明專利及中國發(fā)明專利申請3407條，上述結(jié)果作為統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1.1 相關(guān)專利技術(shù)現(xiàn)狀分析

1.1.1 專利技術(shù)申請趨勢分析

從圖1可以看出，相關(guān)專利申請的申請量總體呈增長趨勢，特別是2014年后增長更為突出，說明土壤污染問題越來越被關(guān)注和重視，越來越多的創(chuàng)新主體積極參與研發(fā)，2018年專利申請量達(dá)到頂峰。由于發(fā)明專利文獻(xiàn)最遲可在發(fā)明專利申請?zhí)岢龊?8個(gè)月公開，因此2020年和2021年提出的專利申請還有部分尚未公開。

圖1 土壤污染修復(fù)技術(shù)申請趨勢圖

1.1.2 專利申請人類型分布情況

通過對3407條專利文獻(xiàn)進(jìn)行分析，專利申請人中大專院校占比最大，其次為企業(yè)、科研單位，余下少量為個(gè)人、機(jī)關(guān)團(tuán)體或其它。圖2表明，目前為止，大專院校和科研單位是技術(shù)研發(fā)和改進(jìn)的主力軍，專利技術(shù)需要積極轉(zhuǎn)化產(chǎn)生價(jià)值，需要進(jìn)一步加強(qiáng)產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，從科研院校的實(shí)驗(yàn)室研究轉(zhuǎn)化為產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用，提高土壤污染修復(fù)的有效性。

圖2 土壤污染修復(fù)技術(shù)申請人類型分布圖

2 土壤污染的類型和危害

根據(jù)污染物類型，土壤污染大致可分為無機(jī)污染物和有機(jī)污染物兩大類。無機(jī)污染物主要包括酸、堿、重金屬、鹽類、放射性元素等。有機(jī)污染物主要包括農(nóng)藥、酚類、氯化物、石油、合成洗滌劑等。土壤污染一方面會(huì)造成土壤肥力降低、土壤退化，甚至導(dǎo)致地下水污染，威脅生態(tài)環(huán)境安全；另一方面土壤中的污染物質(zhì)通過食物進(jìn)入人體，對人體健康構(gòu)成極大危害。可見，土壤污染直接關(guān)系到食品安全和人類健康。

對前述3407條檢索結(jié)果進(jìn)一步細(xì)分，其中涉及土壤重金屬污染及修復(fù)的1126條、涉及有機(jī)農(nóng)藥污染及修復(fù)的1127條，同時(shí)涉及重金屬污染和有機(jī)農(nóng)藥污染的321條。

2.1 土壤污染的類型及重點(diǎn)申請人

圖3顯示，有機(jī)農(nóng)藥和重金屬離子是土壤污染修復(fù)的重點(diǎn)。在有機(jī)農(nóng)藥污染修復(fù)技術(shù)中，中南大學(xué)和湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心專利申請量較多；在重金屬污染修復(fù)技術(shù)中，以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)以及北京林業(yè)大學(xué)、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)4所農(nóng)林院校為主。

圖3 土壤污染修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)類型分布圖

2.2 重金屬污染及其危害

土壤重金屬污染是指由于人類活動(dòng)將金屬加入到土壤中，致使土壤中重金屬明顯高于原生含量、并造成生態(tài)環(huán)境質(zhì)量惡化的現(xiàn)象。重金屬通常是指比重等于或大于5.0的金屬，包括鉛、鉻、汞、鋅、銅、鎳等，砷的化學(xué)性質(zhì)和環(huán)境行為與重金屬多有相似之處，因而在討論重金屬時(shí)往往也包括砷。這些重金屬元素進(jìn)入水體和土壤以后通過植物吸收積累在植物的根、莖、葉、果等可食用部分，或通過葉面直接進(jìn)入植物體，從而對植物和動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用。高濃度的鉛除了在作物可食部分產(chǎn)生殘毒外，還會(huì)導(dǎo)致幼苗萎縮、生長緩慢、產(chǎn)量下降。高濃度的鎘會(huì)使谷物類作物出現(xiàn)類似于缺鐵的萎黃病、枯斑病、萎蔫，葉片產(chǎn)生紅棕色斑塊和莖生長受阻。砷在自然界以不同形態(tài)存在，三價(jià)砷毒性大于五價(jià)砷，大于有機(jī)砷。鉻是人體必需的微量營養(yǎng)元素，但鉻的缺乏或過量將對人體和動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重危害，一般認(rèn)為二價(jià)鉻是無毒的，三價(jià)鉻是動(dòng)物體必需的活性元素，六價(jià)鉻是主要的環(huán)境污染物之一，鉻的毒害主要表現(xiàn)在植物根部、地上部出現(xiàn)缺鐵失綠現(xiàn)象。此外，我國是汞儲(chǔ)備大國，也是土壤汞污染最為嚴(yán)重的國家。近幾年我國人為排汞量在全球排放中的比重持續(xù)增大，每年達(dá)到600t左右。甲基汞的毒性比無機(jī)汞大得多，它是一種親脂性高毒物，能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，為不可逆的中毒反應(yīng)。

2.3 有機(jī)農(nóng)藥污染及其危害

在我國北方地區(qū)，主要農(nóng)作物有大豆、玉米與小麥，同時(shí)還可以種植蔬菜、中草藥以及其他雜糧作物。北方地區(qū)主要以黑土地為主，土壤較為肥沃，只需要施加少量的肥料，即可促進(jìn)作物生長。然而，農(nóng)民為了提高產(chǎn)量、獲得更多的經(jīng)濟(jì)效益，會(huì)過度使用農(nóng)藥，從而對土壤造成嚴(yán)重破壞，對人類生活造成一定威脅。

為了防治植物病蟲草害，在二十世紀(jì)末有機(jī)氯農(nóng)藥被大量生產(chǎn)和過量使用，主要分為以苯為原料和以環(huán)戊二烯為原料的兩大類，前者包括廣泛使用的殺蟲劑DDT和六六六，以及殺螨劑三氯殺螨砜、三氯殺螨醇等，殺菌劑五氯硝基苯、百菌清等。同樣對植物病有防治效果的還包括有機(jī)磷農(nóng)藥，我國水稻田中主要施用有機(jī)磷殺蟲劑，包括有敵敵畏、敵百蟲、樂果、毒死蜱和草甘膦等。

一般認(rèn)為，農(nóng)藥在施用環(huán)境條件中的有效利用率僅僅達(dá)到10%-20%，其余80%-90%的農(nóng)藥流失于農(nóng)田土壤、河流、地下水及揮發(fā)至空氣中。農(nóng)藥首先噴灑至土壤中，然后經(jīng)揮發(fā)和淋溶進(jìn)入空氣和水體中，因此土壤中的農(nóng)藥殘留濃度最大，農(nóng)藥污染程度最高。土壤中殘留的農(nóng)藥會(huì)通過植物的根系活動(dòng)逐漸轉(zhuǎn)移至植物中，使得植物中的農(nóng)藥殘留量增大，影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量。農(nóng)藥進(jìn)入土壤后，除了殺傷防治對象，還殺害土壤中其它的生物群。有機(jī)氯、有機(jī)磷農(nóng)藥還可經(jīng)消化道、呼吸道及完整的皮膚和黏膜進(jìn)入人體。有機(jī)氯農(nóng)藥可引起不同程度的中毒，急性中毒表現(xiàn)為刺激神經(jīng)中樞，慢性中毒表現(xiàn)為食欲不振、體重減輕，也可產(chǎn)生小腦失調(diào)、造血系統(tǒng)障礙等。有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入人體后分布于各器官，以肝臟含量最大，腦內(nèi)含量取決于農(nóng)藥穿透血腦屏障的能力，嚴(yán)重時(shí)可因肺水腫、腦水腫、呼吸麻痹而死亡。

3 土壤污染微生物修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)專利分析

微生物修復(fù)是指利用天然存在的或者篩選培養(yǎng)的功能微生物或微生物群，包括土著微生物、外源微生物、誘變微生物和基因工程菌，在人為優(yōu)化的適宜環(huán)境條件下，促進(jìn)或強(qiáng)化微生物代謝功能，從而達(dá)到降低有毒污染物活性或降低有機(jī)污染物的有效性，從而間接起到修復(fù)污染土壤的作用。通常，一種微生物能夠降解多種有毒污染物，因此微生物修復(fù)成為污染土壤修復(fù)的重要領(lǐng)域。

3.1 從自然界篩選土壤污染修復(fù)微生物

從自然界獲得天然存在的土壤污染修復(fù)微生物的主要方法是從污染環(huán)境中取樣，通過馴化、篩選、分離等操作得到對污染物具有耐受性或者能夠降解、吸附污染物的微生物菌株。由于特定微生物菌株的篩選方法可能涉及不能重復(fù)再現(xiàn)、具有隨機(jī)性等實(shí)用性缺陷，因而保護(hù)主題通常為產(chǎn)品權(quán)利要求。例如：CN111235076B專利文獻(xiàn)公開了一種天神芽孢桿菌及其應(yīng)用。從電鍍廠周邊土壤及水取樣，在含有Ca3(PO4)2 的解磷菌篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，獲得17株解磷菌。進(jìn)一步復(fù)篩，得到四株解磷效果達(dá)到50%以上且對金屬鎘具有修復(fù)效果的菌株，其中菌株P(guān)46效果最佳，經(jīng)鑒定為天神芽孢桿菌。進(jìn)一步通過重金屬修復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，菌株P(guān)46對二價(jià)鎘離子、二價(jià)鉛離子具有較強(qiáng)的鈍化效果，修復(fù)效率分別可達(dá)到60%和83%以上。

CN105602855B專利文獻(xiàn)公開了一株具有廣譜農(nóng)藥降解特性的真菌PA F-2（分類命名為聚多曲霉）及其應(yīng)用。采集湖北省蘄州鎮(zhèn)蘄農(nóng)化工有限公司新廠區(qū)周邊土樣及排水口水樣，富集培養(yǎng)、分離篩選得到一株具有廣譜抗性的真菌PA F-2，能夠降解包括有機(jī)磷（例如敵百蟲）、有機(jī)氯（例如百草枯）在內(nèi)的13種農(nóng)藥。在加入真菌PA F-2后，敵百蟲分子發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致分子內(nèi)的C-P鍵斷裂，從而產(chǎn)生亞磷酸二甲酯和水合氯醛分子，亞磷酸二甲基分子在微生物體內(nèi)進(jìn)一步降解為微生物可利用的磷酸鹽；水合氯醛分子轉(zhuǎn)化為三氯乙醛，水合氯醛以及三氯乙醛在微生物體內(nèi)可被利用為碳源，合成葡糖苷酸，從而促進(jìn)微生物的生長。同時(shí)，真菌PAF-2還可進(jìn)一步降解敵百蟲的水解產(chǎn)物敵敵畏，形成三甲基正磷酸鹽和二氯甲烷，或者發(fā)生水解反應(yīng)形成甲基磷酸二甲酯和不穩(wěn)定化合物二氯乙烯醛，最終也轉(zhuǎn)化為磷酸化合物。

3.2 基因工程化改造土壤污染微生物

盡管從自然界分離篩選的微生物能夠在一定程度上實(shí)現(xiàn)污染物的降解，實(shí)現(xiàn)土壤的修復(fù)，但是其降解類型、降解效率受微生物對污染物降解能力和諸多環(huán)境條件的限制，因而進(jìn)一步提高微生物對污染物的降解能力是本領(lǐng)域的普遍需求。由此，通過基因重組、構(gòu)建高效基因工程菌的研究逐漸展開。構(gòu)建基因工程菌可以考慮重組改造微生物的遺傳背景，引入降解污染物的代謝通路，引入外源基因通過重組互補(bǔ)代謝途徑、改變污染物代謝產(chǎn)物流向來優(yōu)化污染物的降解途徑。例如：金屬硫蛋白是具有結(jié)合金屬能力和高誘導(dǎo)特性的低分子量蛋白質(zhì)，富含半胱氨酸的短肽，對多種金屬具有高度親和性。基于該特性，CN101892187B、CN103205454B專利文獻(xiàn)公開了重組表達(dá)金屬硫蛋白的基因工程菌及其在重金屬修復(fù)中的應(yīng)用。以CN103205454B為例，通過將來源于釀酒酵母的磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因構(gòu)建重組表達(dá)載體，線性轉(zhuǎn)化釀酒酵母S.cerevisiae4126細(xì)胞內(nèi)，篩選具有重金屬吸附功能的金屬硫蛋白轉(zhuǎn)基因酵母。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過表達(dá)金屬硫蛋白的基因工程菌能夠增強(qiáng)宿主對銅、鉻、鎘離子的耐受性，使菌體對重金屬的耐受性明顯提高。并且，金屬硫蛋白轉(zhuǎn)基因重組菌對六價(jià)鉻的還原速率（14h）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于出發(fā)菌（21h），在總鉻的去除率上金屬硫蛋白轉(zhuǎn)基因重組菌也要優(yōu)于出發(fā)菌株。銅離子吸附實(shí)驗(yàn)中，金屬硫蛋白轉(zhuǎn)基因重組菌對銅離子的吸附量是出發(fā)菌株的3倍多，顯著提高了S.cerevisiae4126對銅離子的吸附能力。可見，通過導(dǎo)入具有重金屬吸附功能的金屬硫蛋白多拷貝整合載體能顯著增強(qiáng)S.cerevisiae4126對重金屬的吸附能力。

3.3 土壤污染修復(fù)微生物誘變菌株

人工誘變例如紫外照射、離子束流轟擊等會(huì)導(dǎo)致微生物內(nèi)部產(chǎn)生DNA斷裂、基因突變、基因重組等現(xiàn)象，以誘發(fā)微生物體內(nèi)染色體變異，改變其特性，從而篩選出具有優(yōu)良變異品質(zhì)的土壤污染修復(fù)微生物誘變菌株。例如：CN102690763B專利文獻(xiàn)公開了一種具有解磷能力的成團(tuán)腸桿菌，其是以具有較高解磷能力的成團(tuán)腸桿菌作為出發(fā)菌株，通過紫外線誘變進(jìn)行初篩，選出一株解磷活性高且穩(wěn)定性好的菌株，制成菌懸液，進(jìn)一步通過等離子體誘變復(fù)篩，得到一株耐受重金屬且解磷活性最高的菌株。經(jīng)鑒定，菌株與成團(tuán)腸桿菌具有高度同源性。

3.4 土壤污染微生物復(fù)合菌劑

單一微生物降解菌的降解譜不夠廣、不能完全代謝土壤中的污染物類型是微生物修復(fù)效果欠佳的一個(gè)主要原因。使用特定功能的復(fù)合微生物菌，微生物之間協(xié)同作用，從而改善土壤中難降解的污染物，具有高效率、低成本的特點(diǎn)，在微生物修復(fù)污染土壤的應(yīng)用中具有廣闊的前景。所述微生物可以從保藏菌種庫中篩選獲得，也可以從自然界篩選分離得到。