HPV E6/E7 mRNA在宮頸癌早期篩查與診斷的應用研究

張 明，黃旋妹，劉和錄

(深圳市中西醫結合醫院，廣東 深圳518104)

宮頸癌是嚴重危害婦女健康和生命的惡性腫瘤，在女性常見癌癥中排第4位[1]。全球每年約有53萬宮頸癌新增病例，死亡人數超過27萬，其中有85%發生在衛生資源欠缺的發展中國家，2018年我國約有10.6萬例女性被診斷為宮頸癌，死亡病例高達4.8萬例，新增病例和死亡病例逐年上升，宮頸癌已嚴重危害女性的健康[1-2]。正常宮頸上皮細胞通過宮頸上皮內病變逐步發展為宮頸癌，其中高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續感染是引起宮頸癌的必要條件[3]，如果能通過早期篩查和診斷，在癌前病變階段進行治療，有98%的病例是可以治愈，而一旦疾病發展為癌并擴展至其他器官，女性的5年生存率不超過17%[4]。由于HR-HPV檢查和細胞學檢查對宮頸癌前病變陽性預測值低至44%，且HR-HPV檢查特異度不高[5]，往往給患者帶來心理恐懼或過度檢查。從過往的研究看，HPV陽性宮頸癌病例的發生與HPV基因組整合到宿主基因組有關[6]，E6和E7基因DNA的整合和蛋白的失調表達是HR-HPV病毒導致宮頸病變的重要原因[7-9]。先前的研究表明，HPV DNA檢查相比于HPV mRNA檢查特異性較低，而細胞學檢查也存在一定的滯后性和漏診率[10-11]，因此，檢測作為癌基因表達指標的HPV E6/E7 mRNA 用于早期篩查和診斷宮頸癌在理論上優于直接檢測HPV DNA和細胞學檢查。

目前，檢測HPV E6/E7 mRNA 的方法有多種，包括原位雜交、熒光定量PCR等方法，原位雜交技術無法自動化和高通量檢測，且需要人工判讀結果，易受主觀因素影響，qPCR需要提取mRNA模板和指數級放大檢測信號，其穩定性差且易污染造成假陽性結果。有學者采用流式細胞術檢測宮頸脫落細胞HPV E6/E7 mRNA 取得成功并克服了傳統方法的不足[12]。因此，本研究通過流式細胞術研究HPV E6/E7 mRNA和宮頸病變的發生發展及相關性，為宮頸癌的早期篩查和診斷提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2018年至2019年深圳市中西醫結合醫院宮頸上皮瘤變CIN Ⅱ 11例，CIN Ⅲ 15例，宮頸癌樣本18例以及正常對照樣本16例。該研究中所有樣品均獲患者知情同意和深圳市中西醫結合醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1HPV E6/E7 mRNA表達水平的檢測 (1)樣本黏液液化及樣本的制備：采用含有消化黏蛋白和RNA酶抑制劑的保存液，在10 min內液化樣本使宮頸脫落細胞重懸并防止其降解。(2)細胞固定：采用細胞固定液，使其在30 min內迅速完成固定過程，且達到檢測要求的固定效果。(3)細胞通透：在常規皂素通透劑的基礎上進行工藝和配方優化，選擇合適的濃度及通透緩沖液，使熒光標記的分子信標自由出入于固定好的細胞。(4) 檢測探針設計及熒光標記技術：通過文獻查閱、基因轉錄文庫的序列分析、分子信標的雜交性能評價等過程后，選擇評分高的3組序列，外送專業公司進行序列合成及熒光素標記。最后通過流式細胞檢測進行效果評價后確定。(5) 流式細胞儀檢測熒光信號：正確調整閾值排除碎片干擾，正確進行顏色補償，以校正熒光染料光譜之間疊加所造成的誤差。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA 陽性率的判斷 (1)每個樣品脫落細胞數量大于1000個為合格樣品;(2)陽性樣本的判斷原則：每個樣本中陽性細胞占該樣品中所有細胞的比例大于2%即判定為陽性樣本。

1.3 統計學方法

采用Graphpad prism 5軟件進行數據處理。各項數據采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行分析。P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV E6/E7 在宮頸癌病變中的表達

通過流式細胞術檢測正常對照樣本和宮頸不同程度病變樣本中HPV E6/E7 mRNA水平的變化，結果顯示HPV E6/E7 mRNA 的表達在正常對照組和宮頸病變樣品中具有顯著差異，這表明HPV E6/E7具有作為宮頸病變預測和診斷的分子標志物的潛力,見圖1。

圖1 HPV E6/E7 mRNA在正常對照和宮頸病變樣本中的表達情況

為了進一步了解HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變不同組中的表達情況，對不同樣本中的HPV E6/E7 mRNA的數據進行分析，結果表明HPV E6/E7 mRNA在正常組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組的陽性表達率分別為18.8%、72.7%、80%及88.9%(χ2=21.33，P<0.0001)。HPV E6/E7 mRNA的表達情況：CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組都高于正常組(P<0.05);CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組三組間的差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組HPV E6/E7 mRNA的表達比較

2.2 ROC曲線評估HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變中的診斷價值

為了分析HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變中的診斷價值，將各組別的陽性率進行ROC曲線分析，隨后使用ROC曲線下的相關區域面積(AUC)來評估其診斷潛力，發現HPV E6/E7 mRNA具有顯著區分正常和宮頸病變的潛力，其AUC達0.8778(95% CI 0.7932-0.9624,P<0.0001)。見圖2。

圖2 HPV E6/E7 mRNA的ROC曲線

進一步評估HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變診斷中的靈敏度和特異度，HPV E6/E7 mRNA檢測診斷高級別宮頸病變的靈敏度為81.82%(95% CI 67.29%-91.81%)，特異度為81.25%(95% CI 54.35%-95.95%)，陽性預測值為92.31%(95% CI 79.13%-98.38%)，陰性預測值為61.90%(95% CI 38.44%-81.89%)。見表2、表3。

表2 HPV E6/E7 mRNA檢測與病理檢查結果

表3 HPV E6/E7 mRNA 檢測對宮頸病變的診斷價值(%)

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，大量的流行病學調查和研究表明HPV的持續性感染是宮頸癌發生的首要原因[13]。HPV16和HPV18是最具侵略性的病毒類型[14]，全球絕大部分的宮頸癌的發生與其有關，它們通過持續感染并整合到宿主基因組中，一方面導致各種腫瘤抑制因子的沉默，另一方面誘導各種腫瘤促進因子的激活，最終導致宮頸癌的發生[2]。HPV 基因組的癌基因E6和E7是正常宮頸上皮中腫瘤發生的主要驅動器，它們通過將其DNA整合到宿主染色體脆弱區，使E6和E7蛋白過量表達，這兩種蛋白通過抑制p53、Rb等抑癌基因的功能參與Notch1、Wnt、MAPK、mTOR以及 STAT等相關通路的調控，從而影響細胞的生長、分化及免疫功能，最終導致細胞生長失控并永生化為癌細胞[3,15-18]。由于細胞學形態變化是HPV感染宮頸上皮細胞后引起的，因此細胞學檢查在早期篩查中存在一定的弊端，且常受實驗操作和取材的影響。HPV的早期篩查聯合細胞學檢查能有效的避免單項檢查的不足，提高早期篩查的效率。

本研究利用流式細胞術定量檢測了對照樣本和不同程度的宮頸病變樣本中HPV E6/E7 mRNA的表達情況以評估HPV E6/E7 mRNA作為早期篩查指標的診斷效能。結果發現CIN Ⅱ組(72.7%)、CIN Ⅲ組(80%)和宮頸癌組(88.9%)的HPV E6/E7 mRNA陽性率顯著高于正常對照組(18.8%)，差異具有統計學意義，表明HPV E6/E7 mRNA 作為篩查指標的可行性，但在我們的研究中宮頸病變各組之間HPV E6/E7 mRNA的表達水平沒有顯著差異，這也與其他學者的報道較一致[19]。根據宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA的表達量進行ROC曲線分析，結果顯示ROC曲線下的相關區域面積AUC達0.8778(95% CI 0.7932-0.9624)，差異具有統計學意義，這表明了HPV E6/E7 mRNA作為宮頸癌篩查指標的重要價值，同時我們進一步對比了其他研究的報道，我們發現流式細胞術檢測的HPV E6/E7 mRNA的診斷效能顯著高于HPV DNA的檢測，這與其他學者的報道一致[20-21]，且優于其他方法對HPV E6/E7 mRNA的檢測[19]。因為CINⅡ-Ⅲ 屬于高級別的宮頸上皮內病變，常常需要有創操作進行干預，因此在該研究中我們對CINⅡ級及以上的病變進行深入的分析。本研究發現CINⅡ+ HPV E6/E7 mRNA的靈敏度為81.82%，特異度為81.25%，陽性預測值為92.31%，此結果與學者Kottaridi的研究較一致[12]，可見HPV E6/E7 mRNA可以準確地篩選出宮頸病變高危人群并監測疾病的發展。但該研究中陰性預測值僅為61.90%，其準確性欠佳，因此HPV E6/E7 mRNA作為宮頸癌早期篩查還需要與細胞學檢查等手段聯合分析才能避免漏診，從而更好的為臨床服務。

目前，市面上常見的檢測核酸產品技術主要包括熒光定量PCR技術、核酸原位雜交技術、基因測序技術等。由于這些技術尚存在難以自動化、分析過程復雜、價格昂貴等特點因此較難普及。本技術的試驗操作基本上同傳統的流式細胞術相同，處理96樣本的全程操作到獲得檢測數據僅需2小時時間，節省了至少一倍的時間，全程不需核酸提取和擴增反應;在細胞內直接進行分子信標雜交后上機進行檢測，具有穩定性高、特異性強、靈敏度高、更快速和結果客觀的技術優勢;儀器及試劑價格與熒光PCR比較類似，相信具有較為廣闊的應用前景。