T1期非肌層浸潤性膀胱癌組織中FGFR3與CDKN2A的表達對預后的預測價值

薛亞明，于躍海，晉學飛，晉凡永

(吉林大學中日聯誼醫院 泌尿外科，吉林 長春130033)

膀胱尿路上皮癌(UCB)是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，約有60%-75%的初診UCB為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)[1]。對于這部分患者，通常應用經尿道膀胱電切術(TUR-B)序貫絲裂霉素C或卡介苗(BCG)膀胱灌注治療[2]。雖然膀胱得以保留，但復發率較高，治療后若復查不及時，可能復發并發展為肌肉浸潤性膀胱癌[3]。篩選新的分子標志物，區分不同復發風險的T1期NMIBC患者是目前研究的熱點。

成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)是UCB中最常見的發生過表達和突變的基因，約有40%的UCB患者攜帶FGFR3突變，其中近80%為低級別UCB[4]。目前研究發現，UCB早期即發生FGFR3突變，而FGFR3的過表達與其突變率增加有關[5]。細胞周期素依賴性激酶抑制劑2A(CDKN2A)是抑癌蛋白P16的編碼基因，現有研究發現，當9號染色體9p區域發生雜合性缺失會造成CDKN2A表達缺失，Ploussard 等研究發現CDKN2A與FGFR3之間可能存在相互作用[6]。本研究目的在于觀察FGFR3和CDKN2A在T1期NMIBC的表達情況，并分析其對預后的預測價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料回顧性收集2014年至2016年，在吉林大學中日聯誼醫院泌尿外科行TUR-B治療的NMIBC患者的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)腫瘤樣本，并收集對應的臨床和病理資料。納入標準：(1)所有患者均為初診；(2)T1期NMIBC；(3)所有患者在初次TUR-B治療后6-8周，再次行TUR-B治療。排除標準：(1)TUR-B治療前接受過中醫藥治療；(2)FFPE標本切片少于50%腫瘤細胞；(3)失訪患者。病理分期和分級由兩名正高級病理醫師相互獨立評價，評價依據美國癌癥聯合會(AJCC)2010年發布的第七版TNM分期和世界衛生組織(WHO)2016年發布的膀胱腫瘤分類。腫瘤無復發生存(RFS)定義為以病理學為診斷依據，未發生UBC(包括NMIBC和MIBC)；腫瘤無進展生存(PFS)定義為未發生MIBC或遠處轉移；腫瘤特異性生存(CSS)定義為因腫瘤原因死亡；總生存(OS)定義為因任何原因發生死亡。所有臨床終點均以截至隨訪完成時。

1.2 mRNA表達的檢測本次研究應用RT-qPCR方法檢測mRNA的表達。應用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit試劑盒(Catlog：80004，Qiagen，German)對FFPE標本進行RNA提取。所有操作均嚴格按照說明書進行。提取RNA后，用Nanodrop 2000進行定量并評價提取質量。應用TransScript○RGreen One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒(Catlog：AQ211-01，Transgen，China)對RNA進行逆轉錄，并進行RT-qPCR。本次研究除了檢測FGFR3和CDKN2A mRNA表達水平之外，還檢測基底亞型和管狀亞型的標志物KRT5和KRT20，內參選用Calmodulin-2(CALM2)。各基因PCR引物序列如下：FGFR3，正義鏈：5’-CGTACTGTGCCACTTCAGTG-3’，反義鏈：5’-CCAGCAGCTTCTTGTCCATC-3’；CDKN2A，正義鏈：5’-GAGGGCTTCCTAGACACTCTG- 3’，反義鏈：5’-CGCAAATACCGCA-CGAC- 3’；KRT5：正義鏈：5’- CGGTAGTGGATTTGGTTTCG-3’，反義鏈：5’-TGGTGTTGCGGAGGTCAT-3’；KRT20：正義鏈：5’-GCAGTGGTACGAAACCAACG-3’，反義鏈：5’-CTGCAGCCAGCTTAGCATTG-3’；CALM-2：正義鏈：5’- CCACCATGGCTGATCAACTG-3’，反義鏈：5’-GCCATTGCCATCAGCGTCTA-3’。基因相對定量采用2-△△Ct法計算。

1.3 統計學方法應用Spearman相關性檢驗分析各基因mRNA表達的相關性；應用受試者工作曲線(ROC)中約登指數(Youden’s index)確定每個標志物的最佳分界值(Cut-off value)；應用Kaplan-Meier生存分析曲線進行預后分析；應用Cox多因素回歸風險模型分析臨床、病理因素與預后的關系。應用SPSS 25.0對結果進行分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隊列信息根據納入與排除標準，本次研究共納入62例患者，其中男性42例，女性20例，中位年齡68歲，中位隨訪時間64個月，其中低級別1例(1.61%)，高級別61例(98.39%)，存在淋巴管侵犯1例(1.61%)，無淋巴管侵犯61例(98.39%)，原位癌(CIS)21例(33.87%)，序貫卡介苗膀胱灌注27例(43.55%)，序貫絲裂霉素C膀胱灌注11例(17.74%)。

2.2 FGFR3和CDKN2A mRNA表達與臨床、病理參數的相關性Spearman非參數秩和檢驗結果顯示，FGFR3與CDKN2A mRNA的表達無相關，與KRT5(rs=0.297，P=0.005)和KRT20 mRNA的表達均呈正相關(rs=0.314，P<0.001)；FGFR3高表達與腫瘤分級呈負相關(rs=-0.37，P<0.001)。CDKN2A與KRT5 mRNA的表達呈負相關(rs=-0.331，P=0.021)，而與KRT20 mRNA的表達無相關性。FGFR3和CDKN2A mRNA的表達與年齡、性別和序貫膀胱灌注治療無相關性。

2.3 FGFR3和CDKN2A mRNA表達與臨床結局的關系應用ROC曲線，通過約登指數確定對于不同的臨床結局患者FGFR3和CDKN2A的最佳臨界值，并據此將患者分為FGFR3(或CDKN2A)mRNA高表達組和低表達組。應用Kaplan-Meier分析兩組患者不同臨床結局的差異。結果發現，FGFR3 mRNA高表達組的患者具有更差的RFS，但PFS和OS有所提高，FGFR3 mRNA的表達與CSS無關，CDKN2A mRNA高表達組的患者具有更差的OS，而與RFS、PFS和CSS無關。見表1、表2。

表1 FGFR3表達情況與臨床結局的關系

表2 CDKN2A表達情況與臨床結局的關系

2.4 影響T1期NMIBC患者RFS和OS的單因素和多因素分析在單因素Cox回歸分析中，高齡(≥70歲)、FGFR3高表達和CDKN2A高表達與復發風險增加顯著相關；將這三個因素納入多因素Cox回歸分析中，高齡(≥70歲)和FGFR3高表達與復發風險增加顯著相關。見表3。在單因素Cox回歸分析中，FGFR3高表達與降低OS顯著相關，鑒于FGFR3表達是OS唯一重要的預后標志物，因此沒有對FGFR3進行多變量分析。見表4。

表3 影響T1期NMIBC患者RFS的單因素及多因素Cox回歸分析

表4 影響T1期NMIBC患者OS的單因素Cox回歸分析

3 討論

FGFR3狀態異常(過表達或突變)是UCB發生、發展的主要分子因素之一。目前研究結果認為，FGFR3狀態異常可能是UCB早期的分子事件，且與UCB的分級和預后有關，但FGFR3與生存率的關系并不一致。van Rhijn等人研究發現，FGFR3突變的UCB患者RFS和CSS更長[7]，而Hernández等人則發現FGFR3突變可能會增加TaG1期UCB患者術后的復發率[4]。也有研究認為FGFR3與UCB預后無關[8]。Burger等人分析了221例NMIBC患者FGFR3的狀態，發現存在FGFR3突變的患者，PFS更長，這一點在T1期高級別NMIBC患者中更為顯著[9]。Sikic也得到了類似的研究結果，且對這部分患者進行了分層分析，發現這僅在年輕(<70歲)患者身上呈現相關性[10]。本研究結果也發現，FGFR3 mRNA高表達組的患者復發率更高，但PFS和OS有所提高。目前有幾項研究發現，當FGFR3發生突變后，9號染色體9p區域會發生雜合子缺失，這會影響CDKN2A基因，并導致抑癌蛋白P16的表達降低，從而促進腫瘤進展[11]。Ploussard等人分析了58例NMIBC患者CDKN2A和FGFR3的狀態，發現當9號染色體存在雜合性的患者中，FGFR3是否突變與預后無關，而對于9號染色體雜合性缺失的患者，FGFR3野生型的患者，其復發和疾病進展的風險會顯著高于FGFR3突變型的患者[6]。Rebouissou等人發現，當FGFR3發生突變時，CDKN2A純合子缺失的發生頻率更高[11]。

CDKN2A的表達降低可能與UBC患者的不良預后有關。本次研究發現，CDKN2A mRNA高表達組的患者具有更差的OS，與目前大部分研究結果相似。Breyer等人研究發現當CDKN2A高表達的同時，FGFR3表達降低，這部分患者的PFS最差，對于T1期NMIBC患者，CDKN2A高表達仍是預后較差的預測因素之一[12]。CDKN2A作為一種抑癌基因，目前部分研究呈現出與其功能截然相反的結果，對于CDKN2A mRNA過表達為何會導致預后較差，目前尚不清楚。Lukas等研究認為，CDKN2A發生點突變對于UCB的發生、發展過程意義不大，但CDKN2A可以在抑癌因子RB1的上游發揮作用，其表達與TP53的表達有關，當RB1或TP53發生突變時，可能會減弱CDKN2A的抑癌作用[13]。在TCGA數據庫中，約有50%的NMIBC患者存在TP53突變，13%的患者存在RB1突變，而Meeks等人的隊列中，這兩個基因的突變頻率更高[14]。Al-Khalaf等人研究發現，CDKN2A可以上調與細胞增殖相關基因的表達，如成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)、細胞周期蛋白D1(CCND1)和E2F1轉錄因子1(E2F1)等。通過這種方式間接介導p16的表達[15]。然而，CDKN2A和FGFR3之間尚未顯示出直接關系，這需要進一步研究。

本研究存在一定的局限性，首先是回顧性分析，且隊列中患者數量較少，這限制了該研究的可重復性。其次，沒有分析FGFR3和CDKN2A的聯合表達，并進行分層分析，因為隊列患者數量較少，包括組織學分級為低級別和存在淋巴管侵犯都僅有1例患者，進行更為細致的亞組分析可能得不到任何有意義的結論。此外，僅分析了FGFR3和CDKN2A的mRNA的表達情況，未應用免疫組化方法檢測急性蛋白水平的觀察，且未分析其突變狀態，這些都需要后續改進。

綜上，對于T1期NMIBC患者，FGFR3 mRNA高表達可能預示著較差的RFS，但OS更好。