響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚多糖純化工藝及不同產(chǎn)物的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性比較

靳鐵柱

（西安財(cái)經(jīng)大學(xué)行知學(xué)院，陜西 西安 710038）

桑葚為桑科植物桑樹的成熟果穗，味甜多汁，富含多糖、黃酮、維生素、花色素和人體必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有滋陰補(bǔ)血、生津潤燥的功效，長期食用可增強(qiáng)免疫力，并有助于降糖、降脂，促進(jìn)血紅細(xì)胞的生成[1-2]。有研究認(rèn)為，以上功效的基礎(chǔ)活性成分之一為桑葚多糖。王強(qiáng)等[3]發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖有利于調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的血糖水平，且對(duì)羥基自由基和超氧自由基具有較好的清除作用；韓偉等[4]指出，桑葚多糖對(duì)1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）自由基的半數(shù)抑制率優(yōu)于常用抗氧化劑——抗壞血酸和蘆丁；劉兵[5]利用動(dòng)物疲勞模型研究發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖可顯著提高小鼠的力竭游泳時(shí)間，并降低其運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)血乳酸與尿素氮含量，具有較好的抗疲勞作用。

由于桑葚多糖的傳統(tǒng)制法采用石油醚脫色，Sevag試劑（V氯仿∶V正丁醇=1∶4）去除蛋白質(zhì)，不僅操作費(fèi)時(shí)繁瑣，且易破壞多糖結(jié)構(gòu)，并可殘留有毒溶劑，而大孔樹脂具有穩(wěn)定性高、吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于去除粗多糖中色素與蛋白質(zhì)[6-7]。因此，本研究利用大孔樹脂具有機(jī)械篩分與化學(xué)吸附的特性，吸附桑葚粗多糖溶液中色素與蛋白質(zhì)雜質(zhì)，探討最佳純化工藝條件，并通過動(dòng)物試驗(yàn)比較純化前后多糖化合物的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性，從而為桑葚多糖的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

桑葚，購于西安農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、無水乙醚、三氯醋酸（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-無水葡萄糖對(duì)照品，中國食品藥品檢定研究院；H103、D101型大孔樹脂，粘津浩聚樹脂科技有限公司；HPD300、DA201、DM301、S-8、NKA-9型大孔樹脂，河北滄州寶恩化工有限公司；血乳酸（BLA）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒，廈門侖昌碩生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)試驗(yàn)試劑盒，南京建成生物工程研究所；試驗(yàn)用水為純化水。

SPF級(jí)雄性昆明小鼠（2月齡，體重16～24 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度和相對(duì)濕度分別為20～25℃和50%～70%），購于西安益豐達(dá)生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

L9型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；ME204型電子分析天平，梅特勒-拖利多有限公司；XC-600C型超聲波器，濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司；RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；TD5AWS型低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 桑葚粗多糖制備

稱取500 g桑葚，于60℃烘箱干燥后粉碎，過80目篩，加入95%乙醇溶液1 000 mL浸泡12 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干溶劑，收集桑葚渣于60℃烘干。精密稱取100 g桑葚渣，按照料液比1∶27（g/mL）加入純化水，于72℃、320 W功率下超聲處理25 min，離心回收上清液，將提取液減壓蒸餾濃縮至浸膏后，加入95%乙醇溶液500 mL，4℃下靜置2 h后過濾，重復(fù)2次，合并沉淀物，經(jīng)冷凍干燥后，即得桑葚粗多糖[8]。

1.2.2 樹脂純化效果指標(biāo)測定

1.2.2.1 脫色率

不同樣品溶液分別于450 nm波長測定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算脫色率[9]。

脫色率（%）=（A脫色前-A脫色后）/A脫色前×100

1.2.2.2 蛋白質(zhì)脫除率

采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定不同樣品的蛋白質(zhì)含量[10]，計(jì)算蛋白質(zhì)脫除率。

蛋白質(zhì)脫除率（%）=純化后的蛋白質(zhì)含量/純化前的蛋白質(zhì)含量×100

1.2.2.3 多糖回收率

采用苯酚-硫酸法測定不同樣品的多糖含量，計(jì)算多糖回收率[11]。

多糖回收率（%）=純化后的多糖含量/純化前的多糖含量×100

1.2.2.4 綜合評(píng)價(jià)指數(shù)

參考劉沖英等[12]評(píng)價(jià)大孔樹脂純化地黃粗多糖的方法，對(duì)純化前、后樣品的脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率加權(quán)求和計(jì)算綜合評(píng)價(jià)指數(shù)，以評(píng)價(jià)桑葚粗多糖不同條件下的純化效果，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)計(jì)算公式如下：

綜合評(píng)價(jià)指數(shù)=0.3×脫色率+0.3×蛋白質(zhì)脫除率+0.4×多糖回收率

1.2.3 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

將經(jīng)過預(yù)處理的2 g不同型號(hào)樹脂分別置于100 mL錐形瓶內(nèi)，加入5 mg/mL桑葚粗多糖水溶液20 mL，于25℃振蕩吸附12 h后過濾，分別向過濾后的樹脂中加入50 mL去離子水，于相同條件振蕩解吸12 h后過濾，按照“1.2.2”中所述方法測定處理前、后樣品溶液中色素值、蛋白質(zhì)含量與多糖含量，比較不同類型樹脂的純化能力[13]。

1.2.4 動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)

1.2.4.1 試驗(yàn)步驟

準(zhǔn)確稱取10 g靜態(tài)吸附篩選的最佳型號(hào)樹脂，濕法裝柱（Ф2 cm×50 cm）后，加入一定質(zhì)量濃度的桑葚粗多糖溶液，控制流速為1.0 mL/min上樣后，靜置吸附30 min，采用去離子水作為洗脫液，按照一定流速洗脫目標(biāo)化合物后，測定收集液中脫色率、蛋白質(zhì)去除率及多糖回收率。

1.2.4.2 上樣液濃度考察

固定上樣液體積60 mL，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液體積130 mL，按照“1.2.4.1”試驗(yàn)步驟，考察不同上樣濃度（5、10、15、20、25 mg/mL）對(duì)脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖回收率的影響。

1.2.4.3 上樣液體積考察

固定上樣液濃度15 mg/mL，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液體積130 mL，按照“1.2.4.1”方法，考察不同上樣液體積（20、40、60、80、100、120 mL）對(duì)脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖回收率的影響。

1.2.4.4 洗脫流速考察

固定上樣液濃度15 mg/mL，上樣液體積60 mL，洗脫液體積130 mL，按照“1.2.4.1”方法，考察不同洗脫流速（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min）對(duì)脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖回收率的影響。

1.2.4.5 洗脫液體積考察

固定上樣液濃度15 mg/mL，上樣液體積60 mL，洗脫流速1.0 mL/min，按照“1.2.4.1”方法，考察不同洗脫液體積（100、110、120、130、140、150 mL）對(duì)脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖回收率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以綜合評(píng)價(jià)指數(shù)為考察指標(biāo)，上樣液濃度、洗脫流速與洗脫液體積為考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以確定桑葚粗多糖的最佳純化工藝，具體因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Factorsand levels of response surface experiment

1.2.6 抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性測定

1.2.6.1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

60只健康雄性小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、提取組和純化組，每組各20只。對(duì)照組給予0.85%生理鹽水，而提取組和純化組小鼠每日分別灌胃純化前和純化后的桑葚多糖0.30 mg/g BW，灌胃體積均為0.2 mL/10 g BW，每天經(jīng)口灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d[14]。

1.2.6.2 力竭游泳時(shí)間

末次灌胃后，各組隨機(jī)選擇10只小鼠，于鼠尾綁定重物后，置于泳池內(nèi)，記錄小鼠入水至沉沒15 s無法浮出水面的時(shí)間。

1.2.6.3 血液生化指標(biāo)測定

末次灌胃后，將各組剩余小鼠置于泳池內(nèi)游泳30 min后，取出擦凈，休息10 min，于眼眶處取血離心，利用BLA、LDH檢測試劑盒測定運(yùn)動(dòng)后小鼠血清中BLA含量和LDH活力[15]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖，動(dòng)物試驗(yàn)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果

表2為不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)桑葚粗多糖的靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果。由表2可見，不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)桑葚粗多糖的靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果差異較大。與其他類型樹脂相比，非極性類樹脂對(duì)桑葚粗多糖中色素與蛋白的去除效果較好，且回收率較高。這歸因于色素和多數(shù)蛋白質(zhì)的極性低，與該類型樹脂具有較好的吸附作用，而H103樹脂的比表面積≥900 m2/g，提供的吸附活性位點(diǎn)較多[16]。因此確定采用該樹脂進(jìn)行后續(xù)桑葚多糖純化工藝研究。

表2 不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)桑葚粗多糖的純化效果Table 2 Purification effect of different models of macroporousresin on mulberry crudepolysaccharide

2.2 不同上樣濃度對(duì)純化效果的影響

由圖1可知，H103樹脂對(duì)桑葚多糖的回收率初期較高，可維持在80%左右，但當(dāng)上樣濃度超過15 mg/mL時(shí)回收率開始下降，這源于上樣濃度過高，使得樹脂過飽和吸附，易發(fā)生多糖化合物的泄漏。另外，其對(duì)蛋白質(zhì)與色素雜質(zhì)的吸附量也隨著上樣濃度的增大，而緩慢減少至達(dá)到飽和吸附平衡。因此選擇10、15、20 mg/mL上樣濃度作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的考察水平。

圖1 不同上樣濃度對(duì)脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率的影響Fig.1 Effect of different sample concentrations on decolorization,protein removal and polysaccharide recovery rates

2.3 不同上樣液體積對(duì)純化效果的影響

由圖2可知，隨著上樣液體積的增大，脫色率與蛋白質(zhì)脫除率均逐漸下降，這與張迪等[17]利用大孔樹脂吸附純化雙孢菇多糖研究結(jié)果一致。多糖回收率則在上樣液體積為60 mL時(shí)快速下降，表明上樣量達(dá)到一定體積時(shí)，H103樹脂對(duì)多糖化合物的吸附達(dá)到飽和，繼續(xù)增大上樣量，不利于提高樹脂的吸附效率。因此最佳上樣液體積應(yīng)為60 mL。

圖2 不同上樣液體積對(duì)脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率的影響Fig.2 Effect of different sample volumeson decolorization,protein removal and polysacchariderecovery rates

2.4 不同洗脫流速對(duì)純化效果的影響

由圖3可知，隨著洗脫流速的增大，脫色率與蛋白質(zhì)脫除率均不斷減小，而多糖回收率呈先增大后減小的趨勢。由于洗脫流速過慢，使得洗脫時(shí)間過長，而流速過快，使得多糖洗脫不充分，同時(shí)導(dǎo)致吸附在樹脂內(nèi)的雜質(zhì)易被洗脫。綜合考慮，選擇0.5、1.0、2.0mL/min洗脫流速作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)因素考察水平。

圖3 不同洗脫流速對(duì)脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率的影響Fig.3 Effect of different elution velocitieson decolorization,protein removal and polysacchariderecovery rates

2.5 不同洗脫液體積對(duì)純化效果的影響

由圖4可見，隨著洗脫液體積的增大，多糖回收率逐漸升高至平衡，當(dāng)洗脫液體積為130 mL時(shí)，回收率基本穩(wěn)定，表明吸附在樹脂內(nèi)的桑葚多糖基本流出柱床，而脫色率與蛋白質(zhì)脫除率均緩慢下降，表明有部分蛋白質(zhì)或色素被洗脫。因此選擇洗脫液體積120、130、140 mL作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)因素考察水平。

圖4 不同洗脫液體積對(duì)脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率的影響Fig.4 Effect of different eluent volumes on decolorization,protein removal and polysacchariderecovery rates

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以上樣液濃度（A）、洗脫流速（B）和洗脫液體積（C）為自變量，以桑葚多糖純化效果的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

采用多元回歸擬合表3中的結(jié)果，得到以綜合評(píng)價(jià)指數(shù)為目標(biāo)函數(shù)的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=74.34-0.66A+0.14B+0.015C-0.25AB-0.38AC-0.47BC-3.67A2-2.57B2-1.30C2，對(duì)其進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

由表4可知，通過響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果擬合的回歸模型為極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。模型R2=0.989 4，接近于1，表明模型可靠程度高。另外模型變異系數(shù)CV=0.79%＜1%，可知模型外因素對(duì)結(jié)果的影響較小，該模型可用于實(shí)際結(jié)果的預(yù)測。在所有一次項(xiàng)中，上樣液濃度的影響顯著（P＜0.05），所有二次項(xiàng)影響均為極顯著（P＜0.01）。由F值可知，各因素對(duì)桑葚多糖純化效果的影響大小順序?yàn)椋荷蠘右簼舛龋ˋ）＞洗脫流速（B）＞洗脫液體積（C）。

表4 響應(yīng)面方差分析Table4 Variance analysisof response surface experiment

2.7 響應(yīng)面分析與最佳純化工藝驗(yàn)證

由圖5可見，所有交互曲面，隨著各因素水平的增加，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)均升高緩慢，各因素之間交互作用不顯著。對(duì)上述回歸方程采用一階偏導(dǎo)，預(yù)測最佳工藝條件為：上樣濃度14.5 mg/mL，洗脫流速1.3 mL/min，洗脫液體積130 mL，預(yù)測綜合評(píng)價(jià)指數(shù)為76.2。

圖5 各因素交互作用對(duì)桑葚多糖純化綜合評(píng)價(jià)指數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Responsesurfacemap of interaction of different factorson purificationcomprehensive evaluation index of mulberry polysaccharide

為了驗(yàn)證模型預(yù)測的最佳工藝，采用上樣液濃度14.5 mg/mL，上樣液體積60 mL，洗脫流速1.3 mL/min和洗脫液體積130 mL對(duì)桑葚多糖粗提物進(jìn)行純化，測得樣品中脫色率為78.2%±1.4%，蛋白質(zhì)脫除率為67.3%±2.2%，多糖回收率為81.5%±1.2%，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)76.4±1.5，試驗(yàn)值與預(yù)測值差異較小，表明擬合得到的二次多項(xiàng)回歸模型可較好地預(yù)測考察因素與響應(yīng)值間的關(guān)系。

2.8 桑葚多糖純化前后抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性比較結(jié)果

2.8.1 小鼠力竭游泳時(shí)間比較

由表5可知，與對(duì)照組相比，提取組小鼠的力竭游泳時(shí)間延長了2.6 min，而純化組小鼠的力竭游泳時(shí)間延長了6.1 min，均具有極顯著性差異（P＜0.01），同時(shí)純化組小鼠的力竭游泳時(shí)間較對(duì)照組明顯延長，具有極顯著性差異（P＜0.01）。動(dòng)物的力竭游泳時(shí)間反映其運(yùn)動(dòng)耐力，在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)過程中，肌肉的快速收縮誘導(dǎo)活性氧與NO的水平升高，相關(guān)肌蛋白S-亞硝基化，促使體內(nèi)自由基數(shù)量增多，導(dǎo)致各組織、器官供氧不足，機(jī)體生理環(huán)境發(fā)生改變，不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，從而產(chǎn)生疲勞感[18]。純化產(chǎn)物中桑葚多糖含量增大，致使抗氧化能力增強(qiáng)，有助于進(jìn)一步提高動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力，因此抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用較好，這與張濤濤[14]考察不同杜仲多糖產(chǎn)物對(duì)小鼠的抗運(yùn)動(dòng)疲勞影響結(jié)果相同。

表5 桑葚多糖純化前后對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響Table5 Effect of mulberry polysaccharidesbeforeand after purification on exhaustive swimming time in mice

2.8.2 小鼠血液生化指標(biāo)比較

由于運(yùn)動(dòng)過量導(dǎo)致肌肉收縮加劇，使得供氧不足生成乳酸，四肢開始出現(xiàn)“酸痛”，乳酸脫氫酶可加快體內(nèi)乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，緩解運(yùn)動(dòng)后的機(jī)體不適感[19]，桑葚多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠相關(guān)血液生化指標(biāo)的影響見表6。由表6可知，與對(duì)照組相比，提取組小鼠的BLA含量降低了1.2 mmol/L，差異具顯著性（P＜0.05），LDH活力提高了46.3 U/L，差異具極顯著性（P＜0.01），而純化組小鼠的BLA含量降低了2.3 mmol/L，LDH活力提高了124.1 U/L，差異均具極顯著性（P＜0.01）。灌胃不同純度多糖的兩組動(dòng)物體內(nèi)BLA含量和LDH活力的差異分別為顯著性和極顯著性，表明純化后的桑葚多糖有助于進(jìn)一步提高體內(nèi)乳酸脫氫酶活力，加快運(yùn)動(dòng)時(shí)生成的乳酸代謝。

表6 桑葚多糖純化前后對(duì)小鼠的BLA含量與LDH活力的影響Table6 Effect of mulberry polysaccharidesbefore and after purification on BLA content and LDH activity in mice

3 結(jié)論

色素和蛋白質(zhì)作為桑葚粗多糖的主要雜質(zhì)，會(huì)影響其結(jié)構(gòu)分析與活性，而采用雙氧水法、Sevage法在去除色素與蛋白質(zhì)的過程中，多糖保留率較低。因此，本研究采用大孔樹脂對(duì)桑葚粗多糖進(jìn)行純化，并考察桑葚多糖純化前后對(duì)小鼠抗運(yùn)動(dòng)疲勞效果的影響。通過對(duì)7種大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸性能考察，確定采用H103樹脂純化桑葚多糖粗提物，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳純化工藝為：上樣液濃度為14.5 mg/mL，上樣液體積為60 mL，上樣流速為1.0 mL/min，洗脫流速為1.3 mL/min和洗脫液體積為130 mL。經(jīng)該工藝純化后的桑葚多糖樣品脫色率為78.2%±1.4%，蛋白質(zhì)脫除率為67.3%±2.2%，多糖回收率為81.5%±1.2%，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)76.4±1.5。與粗提物相比，純化后的桑葚多糖可進(jìn)一步延長小鼠的力竭游泳時(shí)間，增強(qiáng)其乳酸脫氫酶的活力，并加快小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)生成的乳酸代謝，具有較好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性，有利于其在營養(yǎng)領(lǐng)域的深度開發(fā)。