生防菌A4的鑒定及其對櫻桃番茄采后主要病害的抑制作用

趙煥蘭，曹嘉燦，管媛媛，張苑珩，劉雯鑫，苗 敏

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

櫻桃番茄（LycopersiconescuLentumvar.cerasiforme）屬于呼吸躍變型果實，采后因生理失調(diào)極易遭受病原微生物的侵染而發(fā)生病害。由灰霉菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病和擴展青霉菌（Penicilliumexpansum）引起的青霉果腐病是櫻桃番茄采后最主要的病害[1-2]。發(fā)病后的櫻桃番茄失去食用價值且影響健康櫻桃番茄的貯藏，造成巨大的經(jīng)濟損失，因此探求防治櫻桃番茄采后病害的有效方法具有重要意義。目前對于櫻桃番茄采后病害的防治以噴施化學(xué)藥物為主，但長期施用化學(xué)農(nóng)藥容易使真菌產(chǎn)生抗藥性，還會破壞生態(tài)環(huán)境和影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，因此亟需探究綠色安全、生態(tài)友好的有效生物防治措施來提高櫻桃番茄采后病害的防治效果。

生防菌是一類抑制病原菌活性、控制病害發(fā)生和發(fā)展的益生菌，主要通過以下機制發(fā)揮作用：與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)及生存空間拮抗其生長，分泌抗菌活性物質(zhì)，吸附在病原菌表面使其斷裂或死亡，誘導(dǎo)寄主抗性增強等[3]。國內(nèi)外眾多研究表明：生防菌能抑制病原真菌活性，從而減輕果蔬采后病害[4-7]。這些研究主要集中在篩選能夠抑制真菌生長且活性穩(wěn)定的芽孢桿菌方面，目前篩選鑒定的生防芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）和蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）。而貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）作為最新發(fā)現(xiàn)的潛力生防菌，對該菌種的鑒定和生防效果的研究較少，是近年來生物防治研究的聚焦點[8]。

菌種種屬的鑒定常通過形態(tài)學(xué)特征、分子序列特性以及菌株的生理生化特征聯(lián)合分析確定。細菌形態(tài)學(xué)鑒定簡單快速，但準確性不強，因此需要結(jié)合分子生物學(xué)方法即16SrDNA、gyrB等細菌的保守序列進一步確定菌屬類別，再結(jié)合目的菌屬的生理生化特征進行聯(lián)合驗證。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)以及生理生化特征分析對菌株A4進行鑒定，結(jié)果顯示菌株A4為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）。進一步以櫻桃番茄采后重要的致病菌灰霉菌（Botrytis cinerea）和擴展青霉菌（Penicilliumexpansum）為指示菌，探究菌株A4對兩種病原菌絲生長的抑制能力以及這兩種病原菌引起的櫻桃番茄采后病害的防治效果及可能的抑菌機理。本研究為生防菌貝萊斯芽孢桿菌的鑒定提供了參考方法，也為櫻桃番茄采后病害的生物防治提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

櫻桃番茄購買于水果超市，取健康且大小均一的果實經(jīng)2%NaClO浸泡2 min，自來水清洗2 min，放置于通風(fēng)處晾干備用[9]。

生防菌A4由實驗室前期從獼猴桃果實上分離并保存；灰霉菌（Botrytiscinerea）由合肥工業(yè)大學(xué)張丹鳳副教授提供；擴展青霉菌（Penicilliumexpansum）由以色列農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究組Samir Droby教授提供，后保存于本實驗室。

蛋白胨、酵母粉、瓊脂、牛肉膏，BioFroxx公司；羧甲基纖維素鈉、(NH4)2SO4、MgSO4，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚紫、酚紅指示劑，生工生物工程（上海）股份有限公司；芽孢染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1118B超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；超低溫冰箱，德國Thermo Scientific；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司；SK-R1807-E標(biāo)準型三維搖床，合肥啟誠生物科技有限公司；S-4800型掃描電鏡，日立公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國伯樂BIO-RAD公司；MJX-100B-Z霉菌培養(yǎng)箱，上海百典儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

LB液體培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl、ddH2O定容至1 L，于121℃下滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl、15 g瓊脂粉，ddH2O定容至1 L，于121℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：200 g去皮土豆、20 g葡萄糖、20 g瓊脂，ddH2O定容至1 L，于115℃滅菌30 min。

1.2.2 生防菌A4的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)觀察：活化保藏菌種接種于LB固體培養(yǎng)基，28℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征。

掃描電鏡觀察：參照馬超[10]的方法操作，稍加調(diào)整。樣品冷凍干燥12 h，然后使用掃描電鏡觀察。

革蘭氏染色：參照冀婉玥等[11]的方法操作。

芽孢染色：使用芽孢染色試劑盒對菌株A4進行芽孢染色，顯微鏡觀察。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

使用DNA提取試劑盒提取生防菌A4基因組DNA，參照李賀海等[12]的方法使用16SrDNA和gyrB基因特異性引物進行PCR擴增。目的基因經(jīng)電泳檢測合格進行序列測定，測序結(jié)果于NCBI中BLAST比對并下載相似度較高的序列。用ClustalW對親緣關(guān)系較近序列進行比對，以鄰接法（Neighbor-joining，NJ）使用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap檢驗重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.2.2.3 生理生化鑒定

參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]和《伯杰細菌鑒定手冊》[14]，以及代玉立[15]和張寶[16]的方法進行生理生化鑒定。

1.2.3 生防菌A4對櫻桃番茄灰霉病及青霉果腐病的抑制效果

1.2.3.1 生防菌A4對灰霉和擴展青霉菌絲生長的影響

操作過程及抑制率計算參照詹藝舒等[17]的方法。

1.2.3.2 生防菌A4對灰霉及擴展青霉在櫻桃番茄體內(nèi)致病能力的影響

無菌打孔器在預(yù)處理番茄果實的赤道部位制造接種點（長3 mm，深約3 mm），定量接種1μL的A4菌懸液，濃度分別為0、0.6×109、0.8×109、1.0×109CFU/mL，并接種1μL濃度為5×106CFU/mL的擴展青霉或灰霉孢子懸浮液，分別記為CK、T1、T2、T3。待菌液吸收后分組放入無菌塑料盒中，于25℃、相對濕度80%～90%條件下貯藏，每24 h觀察并統(tǒng)計計算果實發(fā)病率。每次試驗處理200個果實，試驗重復(fù)3次。

1.2.3.3 生防菌A4抑制灰霉和擴展青霉侵染櫻桃番茄的掃描電鏡觀察

取經(jīng)0和1.0×109CFU/mL A4處理24 h的接種處組織小塊（1 cm×1 cm），按照“1.2.2.1”中的方法準備電鏡樣品。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSSStatistics23.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，差異顯著性采用鄧肯氏多重比較法，采用Origin9.0軟件繪制數(shù)據(jù)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌A4的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征

在LB固體培養(yǎng)基中該菌株形成一個白色不透明、表面粗糙隆起、邊緣不規(guī)則、具有一定厚度的單菌落（圖1A）。掃描電鏡下呈桿狀，平均大小為2.2μm×0.6μm（圖1B），革蘭氏染色呈紫色，表明該菌株為革蘭氏陽性細菌（圖1C），且芽孢染色結(jié)果顯示該菌株可產(chǎn)生芽孢，說明具有產(chǎn)芽孢的能力（圖1D）。根據(jù)形態(tài)特征，參考馬超[10]對芽孢桿菌形態(tài)特征的描述，初步判斷該菌株為芽孢桿菌屬細菌。

圖1 生防菌A4的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristicsof endophytic bacteria A4

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

芽孢桿菌在種間形態(tài)上極為相似，僅根據(jù)形態(tài)無法確定種屬類別，需結(jié)合分子生物學(xué)方法進行具體判斷。本研究參考李賀海等[12]的方法，對菌株A4進行16SrDNA和gyrB基因測序，并分別以菌株A4的16SrDNA的核酸序列（圖2A）及gyrB的核酸序列（圖2B）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，GenBank登錄號分別為MW828618、MW900160。如圖2所示，在16SrDNA序列構(gòu)建的進化樹中，共包含12個核酸序列信息，1 431個建樹位點，采用Kimura 2-parameter方法進行計算。結(jié)果表明，菌株A4與3株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensisstrain Y2（KY887762.1）、Bacillus velezensisstrain NN95（MT114576.1）、Bacillusvelezensisstrain NN05（MT114571.1））單獨構(gòu)成一個分支（圖2A）。在gyrB進化樹中，共包含15個核酸序列信息，1 149個建樹位點，采用Kimura 2-parameter方法進行計算。結(jié)果表明，菌株A4也與3株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensisstrain BCRC 17467（DQ903176.1）、Bacillusvelezensisstrain NN95（MT119763.1）、Bacillus velezensisstrain NN05（MT119758.1））單獨構(gòu)成一個分支，而同屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）的其他菌種則聚于其他幾個組中（圖2B）。

圖2 基于16SrDNA(A)和gyrB(B)序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 NJphylogenetic tree based on 16SrDNA(A)or gyrB(B)sequences

2.1.3 生理生化鑒定

生理生化特性鑒定結(jié)果見表1和圖3。生防菌A4能耐受37℃及含10%氯化鈉的LB培養(yǎng)液；接觸酶反應(yīng)呈陽性；Voges-Proskauer Reaction（V-P）反應(yīng)、厭氧反應(yīng)、苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)均呈陰性。生防菌A4能利用蔗糖、果糖、甘露醇，但不能利用木糖、麥芽糖和檸檬酸鹽；其能水解纖維素、淀粉、酪素、蛋白質(zhì)，但不水解酪氨酸、吐溫80。根據(jù)上述鑒定結(jié)果顯示，生防菌A4與其他貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）報道結(jié)果基本一致[18-19]。

圖3 生防菌A4的生理生化特性試驗Fig.3 Experiments on physiological and biochemical characteristics of endophytic bacteria A4

表1 生防菌A4的生理生化特性Table1 Physiological and biochemical characteristics of endophytic bacteria A4

根據(jù)菌體形態(tài)學(xué)特征、16SrDNA和gyrB的序列分析結(jié)果及生理生化特性，鑒定生防菌A4為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）。

2.2 生防菌A4對櫻桃番茄灰霉病和青霉果腐病的生防效果

2.2.1 生防菌A4對灰霉和擴展青霉菌絲生長的影響

在平板對峙試驗中發(fā)現(xiàn)：接種4 d后，生防菌A4可顯著抑制灰霉菌的生長，且出現(xiàn)明顯的抑菌圈，而對照培養(yǎng)基被菌絲完全覆蓋（圖4A）；統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，生防菌A4對灰霉菌的抑制率從第3天開始逐漸增加，第5天抑制率高達66.56%（圖4B）。生防菌A4對擴展青霉菌的抑制試驗也顯示類似的抑制效果，接種5 d后出現(xiàn)明顯的抑菌圈（圖4C），且抑制率從第4天開始逐漸上升，第6天時抑制率高達59.19%（圖4D）。這些結(jié)果表明，A4菌株可以顯著抑制番茄采后主要病原菌菌絲的體外生長，為該菌株在番茄采后病害防治的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

圖4 生防菌A4對灰霉和擴展青霉菌絲生長的影響Fig.4 Effectsof endophytic bacteria A4 on mycelial growth of B.cinerea and P.expansum

2.2.2 生防菌A4對灰霉菌及擴展青霉菌在櫻桃番茄體內(nèi)致病能力的影響

在探究生防菌A4對灰霉和擴展青霉的體外抑菌效果基礎(chǔ)上，進一步探究其對病原菌果實致病能力的影響。試驗結(jié)果顯示：與對照組相比，A4菌株處理組病原菌的菌絲生長明顯受到抑制（圖5A和5B）。接種灰霉4 d時，對照組果實發(fā)病率高達83.3%，而預(yù)先接種A4菌懸液的處理組其患病癥狀顯著減輕。在不同濃度A4處理后，發(fā)病率分別降低至33.34%、27.34%和14.7%（圖5C）。生防菌A4對擴展青霉的抑制作用更強，接種擴展青霉4 d時，發(fā)病率分別降低至26.00%、8.67%和4.00%（圖5D）。由此可見，A4菌懸液可以顯著抑制灰霉及擴展青霉在櫻桃番茄中的致病能力，從而對灰霉病和青霉果腐病有較好的生防效果。

圖5 生防菌A4對櫻桃番茄灰霉病和青霉果腐病的抑制效果Fig.5 Inhibitory effectsof endophytic bacteria A4 on grey mould and fruit rot of Penicillium in cherry tomato

2.2.3 生防菌A4抑制灰霉和擴展青霉侵染櫻桃番茄的掃描電鏡觀察

在明確生防菌A4能有效抑制灰霉和擴展青霉菌對櫻桃番茄侵染的基礎(chǔ)上，進一步通過掃描電鏡探究生防菌A4的作用機理。結(jié)果顯示（圖6A和圖6B），兩種病原菌侵染番茄果實24 h后，孢子能正常萌發(fā)并形成大量菌絲，成功侵染番茄果實使其患病。而生防菌A4處理組顯示：大量生防菌A4定殖于櫻桃蕃茄，靠近或吸附在灰霉孢子上，造成灰霉孢子干癟、畸形，顯著抑制了灰霉孢子的萌發(fā)（圖6C）；而少量青霉孢子萌發(fā)成菌絲后也顯示斷裂、干癟狀態(tài)，失去致病能力，無法侵染番茄果實（圖6D）。這些結(jié)果表明：生防菌A4可以靠近、吸附或寄生病原菌孢子及菌絲，使其干癟變形、斷裂或死亡，進而降低病原菌對果實的致病能力，減少病害的發(fā)生。

圖6 生防菌A4對灰霉或擴展青霉侵染櫻桃番茄果實的影響Fig.6 Effects of endophytic bacteria A4 on infection of cherry tomatoby B.cinerea and P.expansum

3 結(jié)果與討論

灰霉（Botrytiscinerea）是一種多食性的植物病原菌，在采前和采后均可引起多種果蔬灰霉病。據(jù)報道，灰霉菌可以侵染200多種植物，包括番茄、葡萄、草莓、棗等。由灰霉菌引起的果蔬損失已成為一個世界性難題，造成的損失高達25%～55%，而高達89%的損失發(fā)生在采收后[20]，全世界每年因該病造成的經(jīng)濟損失高達1 000億美元[21]。其中擴展青霉（Penicllium expansum）也是易感染櫻桃番茄的一種病原真菌，其分生孢子能迅速侵染果實表面?zhèn)冢跔I養(yǎng)刺激下萌發(fā)，并完成在果實組織中的滲透和定殖[22]。過去的幾十年里，櫻桃番茄采后保鮮以化學(xué)保鮮技術(shù)結(jié)合低溫、氣調(diào)等物理保鮮技術(shù)為主。然而，化學(xué)產(chǎn)品的過度使用對環(huán)境、食品安全和人類健康造成危害，而物理保鮮技術(shù)成本較高。因此，迫切需要安全環(huán)保的生物源抗菌劑防治櫻桃番茄的灰霉病和青霉果腐病，延長采后果實的貯藏壽命。

本實驗室前期分離篩選得到一株生防菌A4，但未對其進行詳細鑒定。本研究根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定初步判斷該菌株為芽孢桿菌屬細菌。分子生物學(xué)測定16SrDNA和gyrB基因核酸序列顯示：菌種A4與貝萊斯芽孢桿菌的相似度最高，分別高達99.93%和99.43%，并分別構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果均顯示A4與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）之間的親緣關(guān)系最近。同時，生化檢測該菌對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物的驗證結(jié)果與貝萊斯芽孢桿菌的生化特性一致。綜合形態(tài)學(xué)特征、分子序列信息和生理生化特性3方面信息，確定菌種A4為貝萊斯芽孢桿菌。

為了初步探究貝萊斯芽孢桿菌A4的生防能力，以灰霉及擴展青霉為指示菌，探究其對病原菌絲生長的抑制作用以及其對病原菌在櫻桃番茄果實致病能力的影響，結(jié)果表明：生防菌A4可以顯著抑制病原菌絲生長及減弱它們的致病能力。進一步通過掃描電鏡觀察表明，生防菌A4可以靠近、吸附于病原菌孢子或菌絲，使其干癟變形、斷裂或死亡，減少櫻桃番茄的病害。可能是因為生防菌A4能分泌蛋白酶，降解真菌細胞壁及細胞膜中蛋白成分，使菌絲內(nèi)容物滲出，從而導(dǎo)致菌絲死亡。生防菌A4利用其生長的種群優(yōu)勢，大量定殖于櫻桃番茄，一方面可以與病原菌競爭其生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，從而抑制病原菌的生長；另一方面，生防菌A4可以附著在病原菌孢子及菌絲上，依靠病原菌提供的營養(yǎng)為生，從而達到抑菌目的。相關(guān)研究也表明：生防菌在傷口處快速定殖，同時可提高過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性[23-24]，誘導(dǎo)與防御相關(guān)酶的表達，從而提高果實自身的抗性。生防菌常以兩種或三種機制協(xié)同作用于病原菌，減少病害的發(fā)生，因此關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌A4對櫻桃番茄采后病害的抑制機理還需要進一步的探究。