歐李山楂沙棘復合飲料的研制及其抗疲勞研究

王 瑤，徐春暉，杜俊民

（山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619）

身體疲勞是指身體因過度運動而無法維持一定的生理水平或規定的運動強度的狀態[1]。目前有關身體疲勞原因的解釋、能量衰竭和自由基積累相關問題備受關注。近幾十年來，健康學者和運動生理學家越來越關注尋求天然的抗疲勞療法。目前，功能性飲料已經成了現代研究的熱點，一些傳統中草藥（如刺五加）不僅能提高人類的運動能力，加速消除疲勞，而且副作用很小[2-3]。

歐李（Cerasushumilis（Bge）Sok.）為灌木類野生果樹，屬薔薇科櫻桃屬[4]，為我國所特有的第三代小型水果，具有藥食兩用特性，因其富含有機酸[5]、多酚類[6]、氨基酸[6]、多肽[6]等成分，具有抗氧化、抗疲勞、抗焦慮和降血壓等功效，被廣泛用于保健食品[7]。

山楂（CrataeguspinnatifidaBge.）為薔薇科落葉灌木或小喬木植物果實[8]。其主要有效成分有黃酮類、有機酸類、三萜類化合物等[9]，所含糖分易被人體吸收，與有機酸相配合具有抗疲勞作用。

沙棘（HippophaerhamnoidesL.）屬于胡頹子科沙棘屬的一類多年生落葉灌木或小喬木[10]，是一種具有極高利用價值的藥食同源植物[11]。沙棘果中含有多種生物活性成分，具有良好的抗氧化、降血糖和免疫調節等功能[12]，在保健食品、醫療等領域具有重要的開發價值。

已有報道表明，歐李具有一定的抗疲勞作用，在歐李中加入富含抗氧化成分的山楂和沙棘，一方面可以通過兩種特色果汁的自身物性改善歐李飲料的感官品質，另一方面還可能增強歐李中原有的活性成分如花青素、γ-氨基丁酸、鈣等的活性，協同飲料的抗氧化作用，達到良好的抗疲勞效果[13]。本試驗以歐李、山楂和沙棘為主要原料，研制一種復合飲料，并研究其對小鼠的抗疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

SPF級健康雄性小鼠（3周齡，19～21 g）50只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

歐李，山西農業大學鈣果研究組提供；山楂、沙棘，山西呂梁市售；蔗糖，市售；VC，購于河南圣斯德實業有限公司；果膠酶（10 000 U/mL），購于夏盛酶生物有限公司；黃原膠，購于河南萬邦實業有限公司；糖原測定試劑盒、乳酸（BLA）測試盒、血尿素氮（BUN）測試盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒和丙二醛（MDA）測試盒，購于南京建成生物工程研究所；試驗用水為蒸餾水；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器與設備JYL-Y912破壁機，九陽股份有限公司；RE52CS-1旋轉蒸發器、B-260恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；TFC-203PCA型智能土肥養份綜合測試儀，北京強盛分析儀器制造中心；101型電熱鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器有限公司；T2600紫外可見分光光度計，上海祐科儀器表有限公司；BIOBASE-EL10系列自動酶標儀，濟南濟威醫療器械有限公司；800-1離心機，惠智儀誠（北京）科技發展有限公司；XK96-A快速混勻器，江蘇新康醫療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 歐李汁的制備

稱取新鮮歐李果1 kg，清洗、去核、破碎、過濾，加入20 mg/L 0.5%果膠酶，24 h常溫靜置澄清，再加入0.5 g/LVC增加穩定性。

1.2.2.2 山楂汁的制備

稱取新鮮山楂100 g，洗清、去核、切碎，將果肉放入500 mL燒杯中，按液料比3∶1（mL/g）加水浸取山楂汁，在85℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，取出燒杯并用保鮮膜密封，靜置24 h后，過濾，將過濾液在65℃下用旋轉蒸發器濃縮至原來體積的1/2。

需注意不宜把山楂充分破碎，因為漿狀山楂不利于后續的軟化和浸取。

1.2.2.3 沙棘汁的制備

稱取新鮮沙棘100 g，清洗，破碎，過濾，按0.03～0.06g/kg的比例加入果膠酶，常溫靜置24h，取上清液。

1.2.2.4 調配

歐李汁、沙棘汁、山楂汁、蔗糖以一定比例混合成原料液后，加入復合穩定劑黃原膠進行調配。

1.2.2.5 均質、灌裝與滅菌

成品料液在60℃，25 MPa條件下均質10 min后灌裝，90～95℃滅菌15～20 min，冷卻得歐李山楂沙棘復合飲料。

1.2.3 復合飲料感官評價

邀請10名飲料評價人員，對不同配方制得的歐李山楂沙棘復合飲料的色澤、香氣與滋味、組織狀態3方面進行評分，總計40分，具體評分標準見表1。

表1 復合飲料感官品質評分標準Table 1 Sensory evaluation of the compound beverage

1.2.4 復合飲料配方優化

1.2.4.1 單因素試驗設計

在山楂汁添加量20%，沙棘汁添加量0.5%，蔗糖添加量12 g/L的條件下，考察歐李汁添加量（20%、30%、40%、50%、60%）對復合飲料感官品質的影響；在歐李汁添加量40%，沙棘汁添加量0.5%，蔗糖添加量12 g/L的條件下，考察山楂汁添加量（5%、10%、15%、20%、25%）對復合飲料感官品質的影響；在歐李汁添加量40%、山楂汁添加量15%、蔗糖添加量12 g/L的條件下，考察沙棘汁添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對復合飲料感官品質的影響；在歐李汁添加量40%，山楂汁添加量15%，沙棘汁添加量1.5%的條件下，考察蔗糖添加量（12、13、14、15、16 g/L）對復合飲料感官品質的影響。

1.2.4.2 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，以歐李汁添加量（A）、山楂汁添加量（B）、沙棘汁添加量（C）和蔗糖添加量（D）為影響因素，以飲料的感官評分（Y）為考察指標，采用L9(34)正交表進行試驗設計，正交試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factorsand levelsof orthogonal test formula

1.2.5 動物試驗

1.2.5.1 小鼠分組與劑量設計

50只健康雄性小鼠，自由攝食維持飼料，適應性喂養（飼養環境溫度為20～25℃，相對濕度為50%～70%）7 d后，根據體重隨機分為4組，即對照組及低、中、高劑量組，每組10只小鼠。低、中、高劑量組小鼠每日灌胃最佳配方制備的歐李山楂沙棘復合飲料量分別為0.10、0.20、0.3 mL/10gBW，對照組按0.2mL/10g BW給予生理鹽水，全部動物每天灌胃1次，連續灌胃20 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[14-15]。

1.2.5.2 負重游泳試驗

末次灌胃30 min后，各組小鼠于鼠尾負重5%體重鉛皮，于（27±1.0）℃游泳池內開展負重游泳試驗，當小鼠在7 s后不能浮出水面呼吸時，則被認為已力竭[16]。

1.2.5.3 體內生化指標檢測

末次灌胃結束后，各組剩余小鼠自由游泳30 min，取出擦凈，于眼球取血，離心，取血清，于4℃保存血清，按照相關試劑盒說明書要求，檢測各組小鼠血清中BLA與BUN的含量[17]；取血后，將小鼠脫臼處死，取出肝臟，生理鹽水洗清，濾紙擦干，用小鼠肝臟和生理鹽水按照1∶9（g/mL）比例制成10%的肝臟組織勻漿液，離心，取上清液，備用。按照相關試劑盒使用說明，檢測各組小鼠SOD活性、GSH活性、MDA含量及肝糖原（HG）含量[18-20]。

1.2.6 數據處理

使用SPSS 22.0進行數據處理及方差分析，Graphpad Prism6軟件繪圖。試驗數據以±s表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 歐李汁添加量對復合飲料感官品質的影響

由圖1可知，歐李汁添加量較低時，飲料口感酸澀，有分層現象，且歐李的香氣被掩蓋；當歐李汁添加量在40%～60%時，飲料呈紅色，無分層現象，有歐李獨特的風味。考慮到節約成本，選擇歐李汁添加量30%、40%、50%進行后續正交試驗。

圖1 歐李汁添加量對復合飲料感官品質的影響Fig.1 Effect of Cerasushumilis juice addition on sensory of compound beverage

2.1.2 山楂汁添加量對歐李山楂沙棘復合飲料感官品質的影響

由圖2可知，當山楂汁添加量為15%時，感官評分最高，此時飲料口感協調，有歐李獨特的風味，當添加量增加時，飲料口感酸澀，歐李的香氣被掩蓋。因此，選擇山楂汁添加量10%、15%、20%進行后續正交試驗。

圖2 山楂汁添加量對復合飲料感官品質的影響Fig.2 Effect of hawthorn juice addition on sensory evaluation of compound beverages

2.1.3 沙棘汁添加量對復合飲料感官品質的影響

由圖3可知，隨著沙棘汁添加量的增加，感官評分先升高后降低，添加量為1.5%時達到最高。因此，選擇沙棘汁添加量1.0%、1.5%、2.0%進行后續正交試驗。

圖3 沙棘汁添加量對復合飲料感官品質的影響Fig.3 Effect of Hippophae rhamnoides juice addition on sensory of compound beverage

2.1.4 蔗糖添加量對復合飲料感官品質的影響

由圖4可知，隨著蔗糖添加量的增加，飲料的感官評分先升高后降低，這是由于蔗糖添加量過少，溶液口感偏酸，并且香氣混雜；而添加量過多又造成飲料酸甜失調。因此，選擇蔗糖添加量13、14、15 g/L進行后續正交試驗。

圖4 蔗糖添加量對復合飲料感官品質的影響Fig.4 Effect of sucrose addition on sensory of compound beverage

2.2 歐李山楂沙棘復合飲料配方正交試驗優化結果

以飲料的感官評分（Y）為考察指標，進行正交試驗分析。由表3可知，各因素對歐李山楂沙棘復合飲料感官評價的影響順序為：歐李汁添加量（A）＞蔗糖添加量（D）＞沙棘添加量（C）＞山楂汁添加量（B）。由表4方差分析可知，歐李汁添加量對復合飲料配比工藝有顯著性影響（P＜0.05），山楂汁、沙棘汁、蔗糖添加量影響不顯著，最佳配比為A2B2C1D2，即歐李汁添加量40.0%，山楂汁添加量15.0%，沙棘汁添加量1.0%，蔗糖添加量14 g/L。在最佳配比條件下，經3次平行試驗，制得的飲料感官評分為34.3分，高于9組正交試驗結果，此時飲料呈亮紅色、口感協調、組織狀態均勻無分層。

表3 正交試驗結果Table3 Results of the orthogonal test

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variancetable

2.3 歐李山楂沙棘復合飲料對小鼠負重游泳時間的影響

表5為各組動物的力竭游泳時間，由表5可知，與空白組相比，中、高劑量組力竭游泳時間均明顯延長，存在極顯著性差異（P＜0.01）；低劑量組無顯著性差異。負重游泳試驗是最常用的行為絕望動物模型之一，已被廣泛用于評估新型化合物的抗疲勞特性[21]。本研究數據顯示，歐李山楂沙棘復合飲料能顯著延長小鼠力竭游泳時間，提高其運動耐受性。

表5 復合飲料對小鼠力竭游泳時間的影響Table 5 Effect of compound beverage on exhaustive swimming time in mice

2.4 歐李山楂沙棘復合飲料對小鼠血清中尿素氮、乳酸、肝糖原含量的影響

各組小鼠運動后BLA、BUN、HG含量見表6。由表6可知，與空白組相比，中劑量組尿素氮含量具有顯著性差異（P＜0.05），乳酸含量有極顯著性差異（P＜0.01）；高劑量組尿素氮含量及乳酸含量與空白組相比均具有極顯著性差異（P＜0.01）；不同劑量組動物體內HG含量與空白組相比均升高，其中低劑量組有顯著性差異（P＜0.05），中、高劑量組具有極顯著性差異（P＜0.01）。因此可知，歐李山楂沙棘復合飲料有助于減少小鼠運動后BLA及BUN的積累，增加小鼠的HG含量，為其在運動過程中補充能量。

表6 復合飲料對小鼠尿素氮、乳酸和肝糖原含量的影響Table 6 Effect of compound beverage on the contents of BUN,BLA and HGin mice

2.5 歐李山楂沙棘復合飲料對小鼠體內抗氧化能力的影響

由表7可知，與空白組相比，中、高劑量組小鼠SOD活性顯著升高（P＜0.01）；低、中、高劑量組GSH活性均比空白組顯著升高，且均呈極顯著性差異（P＜0.01）；低、中、高劑量組MDA含量均比空白組降低，其中低劑量組為顯著性差異（P＜0.05），中、高劑量組均為極顯著性差異（P＜0.01）。以上試驗結果表明，歐李山楂沙棘復合飲料能提高小鼠體內抗氧化能力。

3 討論

山楂汁之所以濃縮至原體積1/2，是為了增加其濃度和顏色，降低香氣，避免掩蓋歐李果的特殊香氣。單因素試驗中，沙棘汁最佳添加量為1.5%，但經過正交優化后，最佳添加量為1.0%，這是因為沙棘汁添加量較高時，復合飲料的口感偏酸，分層現象嚴重，并且沙棘香氣過于濃郁。

糖酵解是短時間內劇烈運動的主要能量來源，血乳酸是碳水化合物在無氧狀態下的糖酵解產物[22]。血尿素氮是蛋白質和氨基酸的代謝產物。長期運動后，糖和脂肪分解代謝不足，蛋白質和氨基酸的分解代謝會變強，尿素氮顯著增加[23]。此外，糖原是運動時重要的能量來源，增加肝臟中儲存的糖原可以增強運動耐力，消耗肝糖原會產生疲勞[24-25]，因此，本試驗選擇血乳酸、尿素氮、肝糖原為疲勞相關指標。

SOD是一種重要的抗氧化酶,當體內有大量的SOD時，可加速疲勞期后的恢復[26]；當MDA含量過高時，容易抑制ATP的產生并造成疲勞[27]。本試驗通過小鼠抗氧化試驗證明，小鼠每日灌胃歐李山楂沙棘復合飲料濃度增高時，小鼠體內SOD活性上升，MDA含量降低，其間具有顯著的量-效關系。當小鼠每日灌胃復合飲料的劑量為0.3 mL/10 g BW時，其體內SOD活性為（33.45±1.20）U/mg Prot，MDA含量為（1.86±0.13）nmol/mg Prot，此時復合飲料抗氧化抗疲勞作用最佳。

4 結論

在單因素試驗的基礎上，通過正交優化試驗確定了歐李山楂沙棘復合飲料最佳配比為：歐李汁添加量40.0%，山楂汁添加量15.0%，沙棘汁添加量1.0%，蔗糖添加量14 g/L，所得飲料呈亮紅色、口感協調、組織狀態均勻無分層。

以小鼠為研究對象，連續對小鼠灌胃歐李山楂沙棘復合飲料20 d后進行負重游泳試驗，結果表明，歐李山楂沙棘復合飲料可減輕小鼠力竭游泳引起的氧化應激，降低其血乳酸和氨等代謝產物，改善肝糖原的合成和儲備，提高小鼠抗疲勞能力。