香菇GPX基因克隆及其在采后貯藏中的表達分析

韓云云，袁學文，栗藝芳，鄧 冰,*

（1.山西農業大學資源環境學院，山西 晉中 030801；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；3.山西省襄垣縣農業農村局，山西 長治 046200）

香菇（Lentinus edodes）屬擔子菌綱（Basidaiomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomatacete）香菇屬（Lentinus），2020年國內香菇總產量達到1 188.21萬t，在所有食用菌中居于首位[1]。鮮食香菇在貯藏過程中極易發生褐變，造成了嚴重的經濟損失[2-3]。對雙孢菇和杏鮑菇的研究發現，以酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、雙酚氧化酶（Diphenoloxidase，DPO）和漆酶（Laccase，LAC）等為代表的多酚氧化酶（Poly phenol oxidase，PPO）是直接造成子實體褐變的關鍵酶之一[4]。TYR和LAC能催化酪氨酸（單酚化合物）形成3,4-二羥基苯丙氨酸，之后該化合物被進一步氧化成多巴醌，在非酶催化條件下多巴醌轉化為多巴色素（紅色）、5,6-二羥基吲哚和5,6-吲哚醌（黃色），并經過聚合反應形成黑色素（紫色）和黑素（黑色）等褐變物質[4-7]。目前香菇采后褐變過程中發揮主要作用的酶種類尚無定論，同時褐變過程中涉及的生理生化機制和分子機制尚不明確。過氧化物酶（Peroxidase，POD）是真核生物抗氧化系統中的關鍵酶，在機體應答生物脅迫和非生物脅迫相關的生物學過程中發揮重要作用[8-10]。另外有研究表明，在過氧化物氧化相關活性物質產生色素沉積的過程中POD發揮了重要作用，而通過外源處理鈍化POD活性可以有效抑制香菇褐變發生，表明POD可能亦是造成食用菌褐變發生的關鍵酶[11-13]。谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）為含有巰基的POD酶類，目前研究發現GPX在調節機體生長發育、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）代謝和抵抗壓力脅迫等過程中發揮作用，但是對于其在園藝產品采后褐變，尤其是以香菇為代表的食用菌采后褐變發生中的作用機制尚不清楚[14-15]。

本研究基于香菇基因組數據篩選香菇LeGPX基因，通過基因克隆明確其編碼序列，利用生物學軟件預測其基本生物學信息，并通過熒光定量PCR（qRTPCR）技術研究其在香菇采后貯藏中的表達模式，通過以上研究以期為明確香菇采后褐變機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

香菇：于2021年5月采自山西省臨縣山圪嶗農業專業合作社，挑選菌蓋直徑一致、無機械傷且未開傘香菇，采摘后置于4℃貯藏。分別在貯藏0、4、8、12、16、24、28 d留取菌蓋和菌柄部位，所有樣品經液氮速凍后置于超低溫（-80℃）冰箱保存。

總RNA提取試劑盒、克隆載體、DH5α感受態細胞和Transetta感受態細胞：北京全式金生物技術股份有限公司；反轉錄試劑盒、質粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒、無縫克隆試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；pCOLD-ProS2載體：寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.1.2 儀器與設備

NanoDrop ONE超微量分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司；Mini-Sub cell GT電泳系統，CFX96熒光定量PCR儀，美國伯樂科技公司；Tone96G梯度PCR儀，德國耶拿分析儀器股份公司；Tanon4100凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；WSC-S型色差儀，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因鑒定

通過基迪奧云平臺（https://www.omicshare.com/tools/）對課題組已獲得轉錄組數據中所有的編碼基因進行PFAM注釋，以E值＜0.01為準提取包含GPX結構的序列，之后利用NCBIBlastP確定蛋白的保守結構域。使用IBS1.0對蛋白注釋結果和基因結構進行繪制。

1.2.2 基因克隆

1.2.2.1 總RNA提取和反轉錄

參照RNA提取試劑盒說明書提供的方法進行凍存樣品總RNA的提取，用100μL無酶水溶解RNA沉淀，水平電泳檢測RNA提取質量，NanoDrop ONE超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度。以1μg總RNA為模板，參照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄。反應產物稀釋10倍，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2.2 基因克隆

參照“1.2.1”中鑒定的序列，使用Primer 5軟件設計用于PCR反應的擴增引物（表1）。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers in thisstudy

PCR反應體系：1μL模板，上游和下游引物（10μmol/L）各2μL，PCRSupermix25μL，無菌水20μL。

PCR反應條件：95℃變性5 min，擴增28個循環（95℃30 s，55℃10 s，72℃50 s），72℃延伸10 min。水平電泳檢測PCR產物并回收目的片段凝膠，使用試劑盒純化目的片段。將純化產物連接至EASY cloning載體，重組載體轉入大腸桿菌感受態細胞。37℃過夜培養后用PCR驗證陽性菌落，委托上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.2.3 系統發育樹的構建及多序列比對

從NCBI下載部分真菌GPX蛋白序列，使用MEGA6.0軟件構建系統發育樹。參照系統發育分析結果，使用BioEdit軟件對LeGPX蛋白與相近物種GPX蛋白進行多序列比對。

1.2.3 蛋白生物信息學分析

使用在線軟件Sequence Manipulation Suite對蛋白氨基酸組成、分子式和分子質量、帶電荷氨基酸組成和等電點、不穩定系數及總疏水指數進行預測。使用在線軟件Prabi預測二級結構組成及分布，在線軟件SWISS-MODEL構建蛋白質三級結構模型。使用在線軟件ExPASy-ProtScale分析蛋白親疏水基團組成和分布，Excel軟件繪制圖譜。使用在線軟件SignalP 4.1 Server掃描蛋白序列前60位氨基酸中信號肽分布，Excel軟件繪制圖譜。使用在線軟件TMpred Server掃描蛋白全位點跨膜結構，Excel軟件繪制圖譜。使用Cell-Ploc軟件預測亞細胞定位情況。

1.2.4 蛋白原核表達及純化

參照“1.2.2”獲得的序列和pCOLD-ProS2圖譜設計用于構建重組載體的引物，經片段純化和連接構建原核表達載體，PCR驗證載體構建成功后轉入Transetta（DE3）感受態細胞[16]。參照蘇俊等[16]的方法，采用15℃結合異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）誘導蛋白表達，保存誘導前和誘導后菌液，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測蛋白表達情況。采用鎳離子親和純化方法對重組蛋白進行純化，保存貫穿液和各濃度咪唑洗脫液（30、50、100 mmol/L），SDS-PAGE檢測純化效果[17]。

1.2.5 相對表達量測定

將“1.2.2”獲得的cDNA稀釋10倍作為模板，參照確定的基因序列設計用于熒光定量PCR反應的引物（表1），按熒光定量PCR試劑盒說明進行qRT-PCR反應程序。以起始點為對比，使用2-ΔΔt方法進行不同樣品（均包含3個生物學重復）LeGPX基因相對表達量計算[18]。

1.2.6 色差測定

分別于貯藏0、4、8、12、16、24、28 d，使用WSC-S型色差儀測定菌蓋表面標記部位及菌蓋切開后中心部位（菌肉）色差值。不同部位色差值測定均以每5個香菇為一組，分別設置3組重復。

1.2.7 數據統計及分析

使用IBM SPSSStatistics軟件對數據進行方差分析，使用Excel 2016軟件進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 LeGPX基因鑒定

在香菇轉錄組數據中篩選到1條與已知物種GPX基因具有同源性的編碼序列（Coding sequence，CDS）。對該序列編碼的蛋白進行PFAM注釋，結果顯示該蛋白48～156氨基酸殘基為GPX結構域（圖1A），結合CDD注釋結果確定篩選到的序列為LeGPX基因的CDS。對LeGPX基因DNA序列進行分析，結果顯示該基因DNA序列長度839 bp，包含5個外顯子；對該基因上游2 kb序列進行啟動子位點預測，結果顯示該基因的啟動子區位于上游802bp左右（圖1B）。

圖1 LeGPX基因PFAM注釋結果(A)及基因結構(B)Fig.1 PFAMannotation result(A)and gene structure(B)of LeGPX

2.2 LeGPX基因克隆

參照鑒定到的LeGPX基因序列設計用于擴增CDS的引物，以香菇cDNA為模板進行PCR反應，結果顯示PCR產物符合預期大?。▓D2A）；將克隆得到的序列與香菇基因組和轉錄組數據進行比對，結果顯示所得序列與預測序列完全一致。為進一步驗證克隆結果的可靠性，參照已公布的其他真菌GPX氨基酸數據構建了LeGPX蛋白系統發育樹，結果顯示LeGPX蛋白與小皮傘（Marasmiusfiardii）和灰色果腐菌（Moniliophthoraroreri）的GPX親緣關系較近（圖2B）。同時使用BioEdit軟件對LeGPX、MfGPX和MrGPX蛋白的氨基酸序列進行同源比對分析，結果顯示以上蛋白均包含3段GPX特征序列（NTASA(K)CGFT、I(V)L(V)AFPCNQF和KWNFEKFL(V)）以及3個催化殘基位點（圖2C），符合GPX的一般特征[19]。以上結果證實已經成功克隆了香菇LeGPX基因。

圖2 LeGPX基因克?。ˋ）、系統發育分析（B）及蛋白同源比對分析（C）Fig.2 Gene cloning(A),phylogenetic analysis(B)and homologouscomparison(C)analysisof LeGPX

2.3 LeGPX蛋白生物信息學分析

2.3.1 LeGPX理化性質分析采用在線軟件Sequence Manipulation Suite預測LeGPX蛋白的理化性質。LeGPX氨基酸殘基數為206，其中亮氨酸（Leu，8.70%）、蘇氨酸（Thr，7.80%）、丙氨酸（Ala，7.30%）和甘氨酸（Gly，7.30%）為該蛋白中占比最多的幾種氨基酸；分子式為C1029H1599N269O301S8，分子量為22.811 kD；帶正電荷氨基酸（精氨酸和賴氨酸）和帶負電荷氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）數量分別為16和44，理論等電點8.83，為堿性蛋白；不穩定系數31.89（小于50），為穩定蛋白。

2.3.2 LeGPX蛋白二級結構和三級結構分析

使用在線軟件Prabi對LeGPX蛋白的二級結構進行預測。LeGPX蛋白的二級結構以無規則卷曲（46.6%）和α-螺旋（29.1%）為主，延伸鏈和β折疊分別占17.5%和6.8%（圖3A）。使用在線軟件SWISS-MODEL對LeGPX蛋白的高級結構進行預測，結果顯示無規則卷曲為該蛋白三級結構中最明顯的組件；同時該蛋白三級結構中還存在3個可能的催化殘基位點，與蛋白同源序列比對結果相符（圖3B）。

圖3 LeGPX蛋白二級結構（A）和三級結構（B）預測結果Fig.3 Theprediction of secondary structure(A)and tertiary structure(B)of LeGPX protein

2.3.3 LeGPX蛋白親水性分析

親水性分析結果顯示：LeGPX蛋白表面存在198個暴露的親疏水基團，其中氨基酸殘基第75位（纈氨酸）疏水性作用最強，為1.967；第98位（賴氨酸）疏水性作用最弱，為-2.511（圖4）。整體來看LeGPX蛋白表面的總親水位點數量（122個）多于總疏水位點（76個），整體疏水指數為-0.164（圖4），說明該蛋白為親水蛋白。

圖4 LeGPX蛋白親水性分析Fig.4 The hydrophilicity analysisof LeGPX protein

2.3.4 LeGPX蛋白細胞定位與信號肽分析

蛋白質在合成后需要轉運至相應位置發揮作用，明確細胞定位對于探明其生物學功能具有重要意義。使用SignalP4.1 Server軟件預測LeGPX蛋白信號肽，結果顯示前60位氨基酸中最高信號肽分值（Max.C）、最高原始剪切位點分值（Max.Y）和最高綜合剪切位點分值（Max.S）均小于0.5（圖5A），且信號肽預測結果顯示為不存在信號肽。使用在線軟件TMpred Server預測蛋白跨膜結構域，結果顯示該蛋白不存在跨膜結構（圖5B）。綜合信號肽和跨膜結構域預測結果可以說明LeGPX蛋白為非分泌蛋白，該蛋白在合成之后不進入內質網-高爾基體分泌系統，并且不存在進入其他細胞器的可能。使用在線軟件Cell-Ploc分析其亞細胞定位情況，結果亦顯示LeGPX蛋白定位于細胞質。

圖5 LeGPX信號肽和跨膜結構域分析Fig.5 Signal peptide and transmembrane structural domain analysisof LeGPX protein

2.4 香菇GPX蛋白原核表達分析

將構建成功的pCOLD-ProS2-LeGPX載體轉進Transetta感受態細胞，經低溫結合IPTG誘導產生了大小約為50 kD的重組蛋白（圖6中2～7泳道），并且對照組中未出現重組蛋白（圖6中1泳道）。LeGPX-ProS2重組蛋白表達成功，并且外源IPTG濃度不會影響該重組蛋白的積累（圖6中2～7泳道）。使用鎳離子親和純化方法對上清蛋白進行純化，結果發現采用50 mmol/L咪唑可有效洗脫LeGPX-ProS2重組蛋白（圖7）。

圖6 LeGPX蛋白原核表達Fig.6 Theprokaryotic expressionsof LeGPXprotein

圖7 LeGPX-ProS2重組蛋白純化Fig.7 Purification of LeGPX-ProS2 recombinant protein

2.5 LeGPX基因在香菇采后貯藏期間的表達模式分析

香菇在采后貯藏期間會出現明顯的褐變現象，有研究表明該現象的發生可能與代謝產物積累導致的氧化還原失衡有關。如圖8A所示，香菇采后貯藏期間菌蓋表面L*值呈逐漸下降趨勢，反映在子實體上表現為表皮顏色由灰褐色逐步轉變為黑色。菌肉部位發生褐變較晚，該部位L*值表現為貯藏初期無顯著變化，至貯藏中期（12～16 d）和貯藏末期（20～24 d）出現兩次顯著下降（圖8B）。通過相對表達量的分析發現，菌蓋部位LeGPX基因表達量在貯藏期間整體呈先上升后下降的趨勢，采后8、12、16、20、28d時LeGPX基因的相對表達量均顯著高于貯藏初值（P＜0.05），其中采后16、20 d時表達量達到初值12倍左右（圖8C）。菌柄部位LeGPX基因在貯藏初期（4～8 d）即顯著上調表達（15倍），貯藏12～28 d仍保持相對高表達狀態（圖8D）。整體來看，與菌蓋部位相比，香菇采后貯藏期間LeGPX基因在菌柄部位表達更為活躍

圖8 香菇采后L*值及LeGPX基因相對表達量變化Fig.8 L*valuesand the relative expression levels changesof LeGPX gene in postharvest L.edodes

3 討論與結論

真核生物氧化還原系統中存在豐富的抗氧化酶，其中POD是消除活性氧、酚類和胺類等氧化產物的關鍵酶[5]。目前動植物中已鑒定到的POD酶體包括辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）、甲狀腺過氧化物酶（Thyroid peroxidase，TPO）、血紅素過氧化物酶（Heme peroxidase，HP）、木質素過氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、錳過氧化物酶（Manganeseperoxidase，MnP）和GPX等，其中GPX為動物、植物和真菌共有[20]。動物GPX分子結構中一般含有1個硒代半胱氨酸，是酶分子中具有催化活性的作用位點；植物GPX與動物GPX序列高度相似，但是目前尚未發現含有硒的植物，其酶分子催化位點是半胱氨酸（Cystine，Cys）[21]。本研究通過基因克隆明確了LeGPX蛋白的氨基酸殘基序列，通過同源序列比對發現其酶分子中的催化位點（Cys）與植物相同（靈芝以及草菇GPX研究中存在相同結果），并且催化活性區（NTASA(K)CGFT）和標志基序（I(V)L(V)AFPCNQF）也與其他植物GPX相似[19,22]。前期研究發現多種食用菌中均能檢測到硒代半胱氨酸，結合香菇LeGPX催化位點特性，暗示其可能與植物GPX功能類似[23]。除此之外，本研究發現LeGPX蛋白不存在信號肽和跨膜結構域，是定位于細胞質的非分泌蛋白，該結果與多種植物GPX細胞定位情況相同[24]。

菌蓋表皮和菌肉褐變是香菇采后貯藏期間的主要問題之一，目前對于該類褐變發生的機制尚無系統研究。荔枝表皮、鴨梨果心以及雙孢蘑菇表皮采后褐變相關的研究中發現，褐變發生初始階段機體的POD活性會迅速上升，褐變發生中期活性降低并保持平穩，褐變后期POD活性會隨褐變程度加深而逐步升高；POD可能通過催化谷胱甘肽或酚類物質氧化引起呈色物質積累，進而造成機體發生褐變[4,25-26]。本研究發現菌蓋和菌柄部位LeGPX基因在香菇發生褐變前期和末期均會出現顯著上調表達，暗示該基因可能是造成香菇采后褐變的因素之一。本研究還發現，與菌蓋部位相比LeGPX基因在菌柄部位更為活躍。脫離栽培基質后的菌柄可能承擔為彈射孢子提供能量的作用，相比菌蓋該部位代謝更為旺盛，由此造成的氧化損傷產物積累可能是引起香菇褐變發生的誘因。

本研究基于基因組數據鑒定并克隆了香菇LeGPX基因的編碼序列，通過生物信息學分析明確了LeGPX蛋白的生物學特性，通過構建重組載體、原核表達和金屬離子親和純化獲得了LeGPX可溶蛋白，同時借助qRT-PCR方法明確了LeGPX基因在香菇褐變發生中的表達模式。以上結果為深入開展香菇采后褐變發生機制研究提供了基礎。