七曜山海拔高度對百合中薯蕷皂苷含量的影響

龔偉，王夢禪*，游靜，陳聯軍

（1.重慶三峽醫藥高等專科學校；2.重慶三峽抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心; 3.重慶安全技術職業學院，4.萬州區新達百合種植專業合作社，重慶萬州 404120）

本品為百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb、百 合Lilium brownii F.E.Brown var.viridulum Baker或細葉百合Lilium pumilum DC.干燥肉質鱗葉，可食用也可入藥[1]。百合在我國大部分地區均有分布，其中以江蘇、湖南、重慶、四川、甘肅、陜西等地為主要分布區域，其中與重慶毗鄰的湖北利川市七曜山區域也有百合分布[2]。藥用百合含有多種藥效活性成分，主要有多糖、皂苷、生物堿、酚類以及黃酮類化合物等[3-5]。百合中的皂苷是百合的主要生物活性物質之一，中醫認為百合性味甘寒，有清心安神、養陰潤肺的功效，常用于治療虛煩驚悸、陰虛久咳、失眠多夢等癥狀。現代研究表明，百合中的皂苷具有一定的抗抑郁[6]和抗腫瘤活性[7]。由于百合中皂苷的藥理作用顯著，故成為中藥百合質量評價指標之一。

據報道，百合的不同施肥措施和產地差異對百合中皂苷含量有一定的影響，不同的氣候因素[8]、不同的生長年限[9]、不同品種百合[10]的皂苷含量也有一定的差異，但不同海拔高度對百合中皂苷含量的影響未見系統報道。百合種植地域分布廣，海拔差異大，本文主要探討三峽中藥材生產區七曜山區域百合中皂苷含量隨海拔高度變化的趨勢，為百合適宜栽培區域的選擇提供科學依據。百合中皂苷種類較多，而皂苷類物質的檢測常以薯蕷皂苷為檢測指標[11-13]，故本實驗主要通過測定薯蕷皂苷的量來反映百合中皂苷的含量情況。

一、材料與儀器

（一）材料

卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb.），采自七曜山區域重慶市萬州區恒合鄉（H298，H515，H673，H834，H983，H1134）和湖北省利川市謀道鎮（M1246，M1355，M1432）兩個地區（數字為海拔高度），兩地區相鄰，土壤環境和氣候條件相似。采摘樣品經重慶三峽中藥研究所付紹智教授鑒定，均為卷丹百合。樣品剝去肉質鱗葉后，經沸水微燙后烘干備用。薯蕷皂苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）、甲醇、乙腈為色譜純，乙醇、石油醚、正丁醇為分析純，水為超純水。

（二）儀器

高效液相色譜儀（安捷倫1260），蒸發光散射檢測器（Agilent 1260 Infinity），GZX-101電熱鼓風干燥箱（上海圣科儀器設備有限公司），S11-4數顯恒溫水浴鍋（上海博訊），FA1004分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），RE-25B旋轉蒸發儀（上海嘉鵬科技有限公司），FE130型粉碎機，藥典篩。

二、方法

（一）色譜條件

使用Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈-0.2%甲酸水溶液（55∶45）為流動相；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；蒸發光散色檢測器漂移管溫度為46℃，載氣（N2）流速1.6 L/min，通過對標準品和樣品的檢測，得到色譜圖見圖1和圖2。

圖1 標準品HPLC圖譜

圖2 樣品HPLC圖譜

（二）樣品溶液制備[14-15]

樣品經粉碎機粉碎后，過40目藥典篩，所得百合粉末在烘箱中經50℃烘干至恒重，精密稱定百合粉末30 g至圓底燒瓶，加入80%的乙醇200 mL，在70℃水浴下加熱回流3 h，回流提取2次，合并提取液，用旋轉蒸發儀回收乙醇，并減壓濃縮至干，將濃縮后的干殘渣溶于40 mL水中，再用等體積石油醚萃取3次，棄去石油醚，水層再用等體積水飽和正丁醇萃取4次，合并回收正丁醇，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，濃縮殘渣用適量甲醇溶解后，移入容量瓶定容至5 mL，作為樣品溶液備用。

（三）對照品溶液制備

精密稱取薯蕷皂苷對照品約10 mg，加甲醇溶解后，移入容量瓶定容至10 mL，制成1.08 mg/mL的對照品溶液。

（四）薯蕷皂苷標準曲線

精密量取薯蕷皂苷對照品各0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度。在上述色譜條件下各進樣20μL，測定峰面積值，以峰面積和濃度值進行回歸處理，得回歸方程：y=0.173 4x+0.055 8，r=0.999 6。結果表明，薯蕷皂苷濃度在0.108～0.864 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

（五）精密度實驗

取同一對照品溶液進行實驗，每次進樣20μL，連續進樣6次，測定薯蕷皂苷峰面積值，峰面積穩定，RSD為1.2%。

（六）穩定性實驗

取同一樣品溶液進行實驗（產自重慶市萬州區恒合鄉，批號為H983），每次進樣20μL，分別在0，2，4，6，8，12 h各進一針，測定皂苷峰面積值，得到的峰面積穩定，其RSD為1.5%。

（七）重復性試驗

取同一批號樣品（產自湖北利川謀道鎮，批號為M1355）5份，按（二）樣品溶液制備方法制備供試品溶液，按（一）色譜條件，每次進樣20 μL測定皂苷峰面積值，計算薯蕷皂苷含量為5.4 μg/g，RSD為1.4%。

（八）加樣回收實驗

取薯蕷皂苷含量為5.4 μg/g的藥材粉末（產自湖北利川謀道鎮，批號為M1355）6份，經50℃烘干至恒重，各精密稱定約5 g，置具塞錐形瓶中，再加入相當于樣品中薯蕷皂苷含量的80%、100% 和120%的薯蕷皂苷對照品溶液，按（二）樣品溶液制備方法制備供試品溶液，分別注入液相色譜儀測定皂苷峰面積值，計算薯蕷皂苷含量，得到回收率為98.82%，RSD為1.8%。

（九）樣品含量測定

取采集的9個百合樣品藥材，按照操作制備樣品溶液，在圖1和圖2色譜條件下進樣20 μL，測定峰面積并計算薯蕷皂苷含量，結果見表1。

表1 百合中薯蕷皂苷含量

由表1可以看出，海拔300 m左右時薯蕷皂苷含量只有3.85 μg/g，在所有樣品中含量最低，海拔高度升高到500～700 m時，薯蕷皂苷含量較300 m時有明顯變化，升高到4.72μg/g，隨著海拔高度的進一步升高，到達到800 m以上時，薯蕷皂苷含量上升到了5.2 μg/g以上，但在這一階段并不是海拔越高，薯蕷皂苷含量就越高，海拔800～1250 m范圍內，薯蕷皂苷的含量并沒有很大的變化，其中海拔1000 m左右時薯蕷皂苷含量最高，海拔高度上升到1300 m后薯蕷皂苷含量降至5.27 μg/g，1400 m后降至5.21 μg/g。

三、結果

（一）薯蕷皂苷的提取

旋轉了不同比例的乙醇溶液在不同溫度下回流提取百合中的薯蕷皂苷，發現80%的乙醇提取效果最好，溫度對提取的影響相對較低，70℃溫度不會過高，同時又能保證乙醇回流速度，縮短提取時間。

（二）流動相的選擇

選擇了乙腈-水（45∶55）、乙腈-水（55∶45）、乙腈-水（65∶35）、乙腈-0.2% 甲酸（45∶55）、乙腈-0.2%甲酸（55∶45）和乙腈-0.2%甲酸（65∶35）6種流動相進行比較，從整體來看，乙腈-水溶液的洗脫效果不如乙腈-0.2%甲酸溶液，乙腈-0.2% 甲酸溶液中，乙腈-0.2%甲酸（55∶45）流動相的洗脫分離效果最好。

（三）ELSD檢測參數設定

比較了蒸發光散色檢測器在不同漂移管溫度和氮氣流量下峰面積的大小、基線漂移和噪聲情況，發現在漂移管溫度46℃，載氣（N2）流速1.6 L/min條件下，峰形較好，噪聲較低。

（四）百合中薯蕷皂苷含量測定

在三峽庫區七曜山區域，海拔800 m以下時，卷丹百合中薯蕷皂苷含量隨海拔高度升高而升高，在海拔800～1250 m范圍內，薯蕷皂苷含量較高，海拔高度上升到1300 m后薯蕷皂苷含量有下降趨勢，但下降幅度不大。由此可見，海拔800～1250 m范圍適宜卷丹百合總薯蕷皂苷的積累。

四、討論

從實驗結果看，在三峽庫區七曜山區域海拔800～1250 m范圍內，薯蕷皂苷含量較高，適宜發展藥食兩用卷丹百合的生產，但由于七曜山區域海拔高度限制，更高海拔對百合中皂苷含量的影響并未研究。同時，評價百合質量的指標不僅只有皂苷含量，故本項試驗對周邊的川渝地區和鄂西地區的卷丹百合的基地建設選址有一定的借鑒意義，但不能憑本指標選址。