有機磷農藥降解酶opdA的提取和酶學性質

□ 鄭佩華 蘇勝艷

（1.華南農業大學，廣東 廣州 510650；2.瑞辰星生物技術（廣州）有限公司，廣東 廣州 510650）

有機磷農藥是目前我國使用最廣泛的殺蟲劑，長期大量的使用對生態環境和人類健康產生的負面影響越來越嚴重，尤其是在農產品中產生的農藥殘留引起人們的廣泛關注［1，2］。有機磷農藥降解酶通過破壞分子中的磷酯鍵使農藥失去或降低毒性［3］。通常一種有機磷農藥降解酶可同時對多種有機磷農藥起降解作用。生物降解法在農殘降解領域具有極大的潛力［4］。本文選擇工程菌株實現有機磷農藥降解酶opdA在大腸桿菌中的高效表達，通過高壓均質破碎和高速離心分離胞內酶opdA，分析opdA的酶學性質，研究結果為opdA的后續應用奠定了基礎。

一、材料和方法

（一）菌種和質粒

E.coliBL21（DE3）/pET-28a-opdA為本實驗室構建及保存。

（二）培養基和儀器

LB培養基：稱取氯化鈉10g、蛋白胨10g、葡萄糖1g、酵母提取物5g，溶解至1L蒸餾水中；再加入瓊脂15g/L即為固體培養基。

發酵培養基：磷酸二氫鉀72g/L，一水檸檬酸2.0g/L，檸檬酸鐵銨0.3g/L，七水硫酸鎂5.0g/L，甘油3.6g/L，濃硫酸0.02%，微量金屬溶液0.2%，pH調節到4.5～5.0。

UV-1900i分光光度計，日本島津；LYNX6000落地式離心機，ThermoScientific；C1000PCR儀，伯樂生命；SCIENTZ-ⅡD超聲波破碎儀，寧波生物。

（三）培養方法

將實驗室保藏的冷凍菌體取出解凍后，接入裝有LB液體培養基的250mL三角搖瓶，恒溫培養過夜復活菌體，取復活菌體稀釋涂布到LB固體培養基上，培養至長出單菌落后，挑一環接入LB斜面上，37℃培養至長出菌落，這就是E.coli斜面，在生物安全柜的無菌環境中，挑一環接入LB培養基中，恒溫培養至菌體OD600為1.0～2.0，這就是種子液。

將準備好的發酵培養基加入到發酵罐中，種子液按2%的量接入，設定發酵參數進行發酵培養。監測相關參數。待菌量進入對數生長期時，以終濃度為1.0mmol/L的量加入誘導劑IPTG，間隔1小時取樣進行超聲破碎，檢測酶活及菌量，在28℃條件下誘導表達至菌量穩定，酶活最高時，結束發酵。

（四）有機磷農藥降解酶opdA的提取

按上述培養方法收集的菌體，加入勻質緩沖液（60mL/L）和曲拉通TritonX-100（7mL/L），在4℃條件下進行高壓均質破碎，完成破碎后加入終濃度為3mmol/L氯化鋅溶液以穩定酶的結構，破碎后的液料進一步進行離心分離，得到胞內酶opdA，此為粗酶液。

（五）主要試劑

甲基對硫磷純品（北京中科質檢）；蛋白質Marker（Fermantas）；TEMED標準蛋白及其他相關試劑均購自上海麥克林生化科技公司。

（六）蛋白質濃度測定

采用Bradford法［5］，配置系列濃度為0、10、20、40、60、80、100（單位：μg/mL）的牛血清蛋白溶液，加入考馬斯亮藍G-250，測定波長595nm位置處的吸光值，得到回歸方程y=0.0073x+0.0983，相關系數R2=0.9941，樣品蛋白含量通過標準曲線計算。

（七）SDS-PAGE電泳［6］

制備分離膠和濃縮膠，移取經過適當稀釋的粗酶液樣品和蛋白Marker加入到不同樣品槽中，將電泳槽放置到電泳儀上進行電泳。待電泳結束，用R250染色液對電泳凝膠進行染色，然后脫色至背景顏色為透明。估算出有機磷降解酶蛋白的分子量大小。

（八）酶活力的測定方法

1.酶活力測定步驟

準確吸取960μL測試緩沖液于1.5mL離心管中，加入含有20μL濃度為3mmol/L甲基對硫磷-甲醇底物溶液，加入20μL經過適當稀釋的粗酶液，用分光光度計測定在400nm位置處0～5min的吸光度。計算水解產物PNP的含量和opdA酶活［7］。酶活單位定義：室溫下每分鐘水解底物產生1μmolPNP所需要的酶量。

2.標準曲線的繪制

用測試緩沖溶配制濃度為0、5、10、20、40、60、80、100（單位：μmol/L）的硝基苯酚標準系列溶液，在400nm位置比色測得對應的吸光值。得到回歸方程為y=0.017x+0.0085，相關系數R2=0.9998。

二、結果和討論

（一）酶的分離純化

1.硫酸銨的分級沉淀

在冰水浴中向粗酶液中加入占溶液總量的百分比為30%的硫酸銨固體，在0～4℃環境中平衡過夜后，轉移至離心管，超高速冷凍離心后，取出下層沉淀物，溶于少量0.05mmol/LTris-HCl緩沖液中，進一步透析后用聚乙二醇將酶液濃縮，裝瓶冷藏于4℃冰箱種備用。

2.純化結果（見表1）

表1 有機磷農藥降解酶opdA的分離純化

（二）酶學性質研究

后續測定所使用的酶液為高壓均質破碎、高速離心后的粗酶液，測定中的底物均為3mmol/L甲基對硫磷，每個測定條件設置3個平行試驗。

1.酶的純度及分子量

將上述粗酶液分別稀釋10倍、100倍、1000倍，取樣進行凝膠電泳，結果如圖1所示。當樣品稀釋10倍，100倍時，目的蛋白條帶明顯，大小約為35KDa，稀釋1000倍的條帶較淡看不清楚，可得知有機磷農藥降解酶opdA的分子大小為35KDa。

圖1 重組opdA誘導表達的SDS-PAGE分析

2.酶的最適溫度及其穩定性

在pH8.0，不同溫度條件下測定酶活，opdA的最適反應溫度見圖2（a），隨著溫度的上升，opdA酶活先上升后下降。35℃為opdA酶的最適反應溫度。將粗酶液在25～65℃條件下保存4h，期間每隔30min測定1次酶活力，以該酶在各溫度的初始酶活為100%，計算相對酶活。有機磷農藥降解酶opdA在25～40℃酶活穩定，見圖2（b），4h后酶活力仍保持在79%以上。45℃表現出較好的穩定性，保溫4h酶活力后仍有48%。但溫度高于45℃后，有機磷農藥降解酶opdA的穩定性較差，4h后基本都失去了酶活。

圖2 反應溫度對opdA的活力及穩定性的影響

3.酶的最適pH及其穩定性

在25℃、不同pH（4～10）的緩沖溶液中進行反應，測定粗酶液的酶活，如圖3（a），當pH在5.0～9.0時，酶活隨著pH的升高逐漸升高，最適pH為9.0；pH高于9.0后，酶活下降，但在pH為10.0時還保持80%左右的酶活力。將粗酶液保存在不同pH（4，5，6，7，8，9，10）緩沖液中，在室溫（25℃）下放置4h，期間每隔0.5h測定1次酶活，以該酶在各pH的初始酶活為100%，計算該酶各時間段所對應的相對酶活。如圖3（b）所示，有機磷農藥降解酶opdA在pH6～10都具有較好的穩定性，4h后仍能保持90%以上的酶活，當pH值為4～5時，酶活力快速下降。

圖3 反應pH對opdA的活力及穩定性影響4.金屬離子對酶活的影響

配置濃度不同金屬離子溶液，使稀釋后的待測粗酶液中金屬離子的終濃度為10mmol/L，室溫（25℃）保存30min，測定酶活。以去離子水稀釋的酶液作為空白對照，結果如圖4所示。Mg2+、Mn2+對opdA有一定促進的作用，Fe2+、Al3+對opdA表現較強的抑制作用，K+、Na+等其他金屬離子對opdA活性影響不顯著。

圖4 不同金屬離子對opdA酶活力的影響

5.有機磷農藥降解酶opdA廣譜性測試

選用甲基對硫磷、敵百蟲、敵敵畏、辛硫磷、毒死蜱等5種農藥，利用膽堿酯酶抑制率法進行有機磷農藥降解酶opdA對不同有機磷農藥殘留降解效果的研究，在測試緩沖溶液中加入一定量的農藥標準液，測試組分別加入50ppm有機磷農藥降解酶opdA，對照組加入等量去離子水，靜置10min后取樣檢測農殘，具體結果如圖5所示。加入有機磷農藥降解酶opdA進行酶處理的所有組別中，膽堿酯酶抑制率均低于50%，為農殘陰性；而對照組的膽堿酯酶抑制率均在93%以上，為陽性。實驗結果表明，有機磷農藥降解酶opdA對本次實驗所選的5種不同的有機磷農藥均有不同程度的降解能力，僅經過10min時間處理即可使農藥降解，測試結果由陽轉陰，降解酶opdA的廣譜性佳。進一步研究該酶的應用，對消除環境或者農產品中的農藥污染具有廣泛的應用前景。

圖5 有機磷農藥降解酶opdA對不同有機磷農藥降解效果圖