微小RNA-21和程序性細胞死亡因子4在慢性阻塞性肺疾病患者支氣管肺泡灌洗液肺泡巨噬細胞中的表達研究

郭青春, 張杰根, 高雅倩, 呂永盛, 周鵬飛, 李欽招

(河北省涿州市醫院 呼吸與危重癥醫學科, 河北 保定, 072750)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床較為常見的慢性肺部疾病，以進行性氣流受限為臨床表現，損害肺功能，嚴重威脅患者生存質量[1]。目前, COPD發病相關因素尚未完全闡明，但學者認為其發病與免疫紊亂、炎癥反應、微小RNA(miRNA)等相關[2-3]。miRNA可調控有關基因轉錄、表達，其可能參與并影響COPD病理發展過程[4], 其中miR-21可通過增加自噬，進而在COPD發生發展中起重要作用[5]。此外，程序性細胞死亡因子4(PDCD4)在非小細胞肺癌中表達下調，其可能在非小細胞肺癌病變過程中發揮作用[6]。但miR-21、PDCD4在COPD患者肺泡灌洗液(BALF)肺泡巨噬細胞(AM)中的表達及兩者聯合診斷COPD的研究較少。基于此，本研究通過檢測COPD患者BALF AM中miR-21、PDCD4表達情況，有效克服了傳統檢測血清/血漿中待測指標受多種因素的影響，可較為準確地反映兩者相關性及其診斷COPD的價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月—2020年1月河北省涿州市醫院診治的135例COPD患者(COPD組)，其中COPD穩定期患者62例(COPD穩定組), COPD急性加重期(AECOPD)患者73例(AECOPD組)。135例患者中男95例，女40例; 年齡48～75歲，平均(62.59±7.70)歲; 體質量指數(BMI)為18.74～26.56 kg/m2, 平均(23.83±2.46)kg/m2。另選取同期73例因喉部異物感、咳嗽等原因做纖維支氣管鏡檢查的健康者為正常組，其中男50例，女23例; 年齡48～76歲，平均(63.27±7.93)歲; BMI為18.93～25.07 kg/m2, 平均(22.64±2.27)kg/m2; 均無吸煙史或戒煙5年以上，且臨床診斷及鏡檢無明顯病變。另外，收集所有受試者入院時用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)，計算FEV1/FVC及FEV1占預計值百分比(FEV1%)。

診斷標準: 根據《慢性阻塞性肺疾病診治指南》[7]有關COPD診斷標準進行判定。納入標準: 患者均符合COPD診斷標準，結合胸片、臨床表現、病史及有關實驗室檢查將患者判定為AECOPD/COPD穩定期患者; 患者均知情同意。排除標準: 合并血液病和心、肝、腎器官功能損害者; 合并支氣管擴張、間質性肺纖維化、免疫風濕病、哮喘、肺結核、惡性腫瘤者; 合并妊娠者; 不能配合肺功能檢查者。COPD穩定期診斷標準: FEV1/FVC<70%，近2個月內咳嗽、咳痰及呼吸困難無明顯加重者。AECOPD診斷標準: 二氧化碳分壓>50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa), 呼吸頻率>30次/min, 氧分壓<60 mmHg，同時伴有咳嗽、咳痰及呼吸困難癥狀明顯加重者。患者或其家屬簽署知情同意書，本項研究符合《赫爾辛基宣言》，獲得本院倫理委員會批準(批準號LL2017150215-0008)后進行。

1.2 試劑與儀器

Trizol Reagent(B1277)購買于上海西唐生物科技有限公司, Transcriptor One-Step RT-PCR Kit(4655885001)購買于上海意杰生物科技有限公司, Perfectstart SYBR Green qPCR master mix(TQ2300-01)購買于上海瑤韻生物科技有限公司。

核酸蛋白質分析儀(ND-3800Q3000)購買于北京儀器有限公司，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(MA-4800)購買于蘇州雅睿生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集: 入院24 h內，使用100 mL生理鹽水對所有受試者行支氣管鏡肺泡灌洗術，負壓回收量>40%定義為回收成功，利用Ficoll密度梯度離心及貼壁法原代分離BALF中AM, 于37 ℃、5% CO2條件下培養12 h后，備用。

1.3.2 qRT-PCR法檢測BALF AM中miR-21、PDCD4mRNA表達水平: 無菌環境條件下，按Trizol法提取所有BALF AM樣本總RNA，使用核酸蛋白質分析儀檢測RNA純度及質量。取2 μg總RNA, 參考Transcriptor One-Step RT-PCR Kit逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，獲得cDNA。以U6/GAPDH為內參, cDNA為模板，依據Perfectstart SYBR Green qPCR master mix說明書流程進行PCR擴增檢測, PCR反應條件為: 97 ℃預變性3 min; 95 ℃變性35 s, 64 ℃退火/延伸40 s, 40個循環。miR-21、PDCD4分別以U6、GAPDH為內參，引物序列見表1。以2-△△CT法計算miR-21、PDCD4mRNA相對表達量。

表1 miR-21、PDCD4及內參U6、GAPDH的引物序列

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 各組一般資料比較

正常組與COPD組性別比例、年齡、BMI等比較，差異無統計學意義(P>0.05)。COPD組患者FEV1%及FEV1/FVC水平低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組一般資料比較

2.2 各組BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA表達水平比較

COPD穩定組、AECOPD組患者BALF AM中miR-21表達水平均高于正常組，PDCD4mRNA表達水平均低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05); AECOPD組患者BALF AM中miR-21表達水平均高于COPD穩定組,PDCD4mRNA表達水平低于COPD穩定組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA

2.3 COPD患者BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA表達水平與肺功能指標相關性

COPD患者BALF AM中miR-21表達水平與FEV1%、FEV1/FVC均呈負相關(P<0.05);PDCD4mRNA表達水平與FEV1%、FEV1/FVC均呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 COPD患者BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA

2.4 COPD患者BALF AM中miR-21表達水平與PDCD4 mRNA水平的相關性

COPD患者BALF AM中miR-21表達水平與PDCD4mRNA水平呈負相關(r=-0.467,P<0.05)。見圖1。

圖1 COPD患者BALF AM中miR-21表達水平與PDCD4 mRNA水平的相關性

2.5 BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA表達水平對COPD的診斷價值

ROC曲線顯示, BALF AM中miR-21對COPD診斷的曲線下面積(AUC)為0.844(95%CI: 0.791～0.897), 截斷值為1.54, 約登指數為0.567, 其靈敏度、特異度分別為70.4%、86.3%; BALF AM中PDCD4mRNA對COPD診斷的AUC為0.849(95%CI: 0.791～0.906), 截斷值為0.70, 約登指數為0.586, 其靈敏度、特異度分別為77.8%、80.8%; 兩者聯合診斷COPD的AUC為0.903(95%CI: 0.855～0.951), 約登指數為0.753, 其靈敏度、特異度分別為90.4%、84.9%。見圖2。

3 討 論

COPD主要表現為肺泡結構破壞、氣道炎癥及氣道重塑，可導致呼吸衰竭、肺心病，對患者生命安全及工作構成極大威脅[8]。因此，尋找可早期診斷COPD、評估患者病情的指標，及時給予適當干預，對改善COPD患者生活質量有一定的積極意義。

miRNA可在氣道重塑、免疫調節、自噬、信號傳導、炎癥反應、血管重構、細胞增殖、凋亡等過程中起調控作用，其與肺癌、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、COPD等肺部疾病密切相關[9-12]。研究[13]發現, miR-21可促進細胞遷移，參與血管新生過程，并參與機體免疫調節過程，其在COPD小鼠肺組織中表達失調，與肺功能呈負相關，可作為診治COPD的靶標，且其水平有助于評估COPD嚴重程度; 另外, miR-21在COPD患者血清中表達上調，其可能通過參與炎癥反應，影響肺血管重塑、蛋白酶及抗蛋白酶活性，從而在COPD發生發展中起促進作用[14]。本研究中AECOPD組患者BALF AM中miR-21表達水平明顯高于COPD穩定組及正常組，且COPD穩定組患者BALF AM中miR-21表達水平明顯高于正常組，提示miR-21異常表達可能與COPD發生發展進程關系密切，BALF AM miR-21表達水平有利于評估COPD患者病情嚴重程度，推測高水平miR-21可能通過促進炎癥反應，改變蛋白酶及抗蛋白酶活性，促使肺血管重塑等過程，進而促進COPD發生發展，但其具體生物作用機制有待深入研究證實。

研究發現,PDCD4是常見的抑癌基因，其可能通過影響相關信號通路，抑制肺癌發生發展,PDCD4可能是治療肺癌的潛在靶標[15]; 另外,PDCD4在哮喘中表達異常，其可影響支氣管膠原沉積、氣道嗜酸性粒細胞浸潤、黏液產生，其有望成為變應性肺部炎癥類疾病氣道重塑的指標[16]。上述研究表明，表達異常的PDCD4可能在肺部疾病中具有重要作用。相關研究[17]發現, COPD等慢性呼吸道疾病患者發生肺癌風險更高, miR-21及其靶基因PDCD4在COPD相關的肺癌中呈異常表達，兩者可能在肺癌病變過程中起作用。本研究中AECOPD組患者BALF AM中PDCD4mRNA表達水平明顯低于COPD穩定組、正常組，且COPD穩定組BALF AM中PDCD4mRNA表達水平低于正常組，提示PDCD4可能參與并影響COPD發病進程，檢測BALF AM中PDCD4mRNA表達水平有助于判定COPD疾病嚴重程度，其可能原因是低水平PDCD4可能通過增強炎性細胞浸潤影響有關信號轉導等過程，從而影響COPD發生發展，但仍需進一步探究其作用機制。

FEV1%、FEV1/FVC分別用于評價COPD嚴重程度、氣流受限[18]。本研究中COPD患者BALF AM中miR-21表達水平與FEV1%、FEV1/FVC均呈負相關,PDCD4mRNA表達水平與FEV1、FEV1/FVC均呈正相關，提示miR-21、PDCD4可能與呼吸功能相互影響，從而共同影響COPD疾病進程。進一步研究顯示, COPD患者BALF AM中miR-21表達水平與PDCD4mRNA水平呈負相關，提示miR-21可能與PDCD4相互作用，進而協同影響COPD發生發展，但兩者相互作用機制仍需深入研究。本研究發現, BALF AM中miR-21、PDCD4mRNA診斷COPD的AUC分別為0.844、0.849, 當BALF AM中miR-21相對表達量高于1.54或PDCD4mRNA低于0.70時, COPD發生概率增加，提示BALF AM中miR-21、PDCD4mRNA對COPD有一定診斷價值, miR-21、PDCD4mRNA聯合診斷COPD的AUC為0.903, 相應靈敏度為90.4%, 特異度為84.9%, 提示兩者聯合可提高對COPD診斷的靈敏度，增加對COPD的診斷效能。

綜上所述, COPD患者BALF AM中miR-21表達升高,PDCD4表達降低, miR-21可能與PDCD4相互作用，進而共同在COPD發病過程中發揮重要作用，檢測BALF AM中miR-21、PDCD4表達水平有利于臨床診斷COPD及判斷COPD患者病情嚴重程度。但本研究未深入探究miR-21、PDCD4在COPD中的具體生物作用機制，且樣本量較少，后期將擴大樣本量進行探討。