川龍抑癌湯治療前列腺癌的作用機制探討

李文驥, 胡 芳, 徐 魏

(揚州大學醫(yī)學院, 1.江蘇省中西醫(yī)結合老年病防治重點實驗室,2.中馬分子腫瘤及中藥遞送國際聯(lián)合研究中心, 江蘇 揚州, 225000)

前列腺癌是威脅男性生命健康的常見疾病之一，發(fā)病例數(shù)在全球新發(fā)癌癥病例中位列第4，其發(fā)病率與病死率在男性最常見癌癥類型中僅次于肺癌，且發(fā)病率仍在持續(xù)上升[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療有助于改善晚期前列腺癌患者的相關癥狀，延長生存期，對放化療等治療造成的不良反應有一定減輕作用，可提高患者生活質量。前列腺癌在中醫(yī)學中歸于“癃閉”“癥瘕積聚”等范疇，基本病機為正虛導致膀胱氣化不利，濕熱痰濁瘀毒阻滯[4]。川龍抑癌湯[5]是近代醫(yī)家在PC-SPES[6]基礎上總結臨床經(jīng)驗，根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論加減所得，全方組成包括靈芝孢子、地龍、莪術、川足、三七粉、紅花、大青葉，具有扶正益氣、活血化瘀的功效。研究[7-8]表明，川龍抑癌湯聯(lián)合抗雄激素治療或經(jīng)尿道前列腺切除(TURP)術治療晚期前列腺癌均取得了顯著效果，可改善患者臨床癥狀，且具有較高安全性。但目前關于川龍抑癌湯治療前列腺癌作用機制的研究較少，缺乏細胞及分子水平上的系統(tǒng)闡述。網(wǎng)絡藥理學[9]是基于系統(tǒng)生物學、多向藥理學、基因組學等學科理論，運用高通量篩選、網(wǎng)絡分析等技術，反映“中藥成分-靶點-疾病”作用關系的綜合性研究方法，有利于解析中藥復方的配伍規(guī)律及作用機制。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法分析川龍抑癌湯治療前列腺癌的潛在活性成分、作用靶點及機制，旨在為后期實驗研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索靈芝、紅花、三七、莪術、大青葉的化學成分，以口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18為條件進行篩選，獲取有效成分。川足、地龍為動物藥，尚未被TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄，需在中國知網(wǎng)、維普、萬方、PubMed等數(shù)據(jù)庫進行檢索，通過PubChem平臺查詢成分的簡化分子線性輸入規(guī)范(SMILES)結構，將SMILES結構輸入Swiss ADME[10]網(wǎng)站進行篩選，篩選條件包括藥代動力學和類藥性相關參數(shù)，即胃腸道吸收(GI absorption)結果為“High”, 5種類藥性(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)結果中有2個及以上為“Yes”, 以此作為具有較好口服生物利用度和類藥性。將篩選得到的活性成分SMILES結構輸入SwissTargetPrediction[11]網(wǎng)站，設置“Homo Sapiens”, 以“probability>0.1”為篩選條件，預測潛在靶點。

1.2 前列腺癌相關靶點篩選

通過GeenCards、OMIM及PharmGkb數(shù)據(jù)庫檢索“Prostate Cancer”, 得到前列腺癌相關靶點，構建前列腺癌靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 中藥成分-疾病靶點網(wǎng)絡構建及可視化分析

為明確川龍抑癌湯成分與前列腺癌潛在靶點間的相互作用，利用Hiplot在線工具將成分靶點與疾病靶點取交集，通過Venn圖展現(xiàn)交集靶點，運用Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化分析，構建中藥成分-交集靶點網(wǎng)絡圖。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡構建及關鍵靶點驗證

將篩選得到的川龍抑癌湯-疾病共同靶點上傳至STRING在線平臺，選擇“Homo Sapiens”, 設置置信度0.4, 構建PPI網(wǎng)絡模型，下載TSV文件，導入Cytoscape 3.8.2, 通過Cytohubba插件篩選排名前30的關鍵靶點蛋白并輸入GEPIA數(shù)據(jù)庫，驗證其在前列腺癌組織中的表達是否存在意義。

1.5 基因富集分析

將川龍抑癌湯與前列腺癌的交集靶點上傳Hiplot在線平臺，以P<0.05為篩選條件進行基因本體(GO)功能分析，了解川龍抑癌湯的主要作用過程，采用京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析觀察靶點分布的通路情況，探討川龍抑癌湯治療前列腺癌的生物學過程及信號通路。

1.6 主要活性成分與關鍵靶點的分子對接

選取川龍抑癌湯中3個主要活性成分(槲皮素、β-谷甾醇、姜黃素)與3個關鍵靶點[基質金屬蛋白酶-9(MMP9)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、血管內皮生長因子A(VEGFA)]進行分子對接，通過PubChem在線網(wǎng)站獲取活性成分的2D結構保存為SDF格式，將其導入Chem3D, 經(jīng)計算后獲得mol2格式。利用PDB數(shù)據(jù)庫下載關鍵靶點的3D結構，通過PyMOL軟件去水及小分子配體后，利用AutoDockTools 1.5.6軟件獲取成分與靶點的pdbqt文件，最后運用Vina進行分子對接，并通過PyMOL軟件對結果進行可視化展現(xiàn)，一般以結合自由能<-5 kcal/mol為具有較好結合性。

2 結 果

2.1 川龍抑癌湯的有效成分及作用靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫按照條件篩選得到成分數(shù)為靈芝61個、莪術3個、紅花22個、三七8個、大青葉10個，手動搜索并通過PubChem、Swiss ADME篩選得到川足[12]成分19個(見表1)、地龍[13]成分26個，經(jīng)SwissTargetPrediction預測并篩重后共得到575個靶點。

表1 中藥川足的活性成分

2.2 前列腺癌靶點檢索及獲取交集靶點

在Genecards、OMIM及PharmGkb數(shù)據(jù)庫中檢索關鍵詞“Prostate cancer”, 篩重后共獲得10 207個前列腺癌疾病靶點，利用Hiplot在線工具獲得川龍抑癌湯與疾病靶點交集Venn圖，顯示共有486個交集靶點，見圖1。

圖1 川龍抑癌湯有效成分靶點與前列腺癌相關靶點Venn圖

2.3 川龍抑癌湯成分-靶點網(wǎng)絡構建及可視化分析

通過Cytoscape 3.8.2軟件計算川龍抑癌湯中藥成分與交集靶點的相互作用關系，其中共包含656個節(jié)點、1 641條邊, Dgree結果顯示，川龍抑癌湯治療前列腺癌的主要成分包括槲皮素、β-谷甾醇、亞油酸、二氫辣椒素(DHC)和姜黃素等。

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及關鍵靶點基因的驗證

將篩選得到的486個共同靶點上傳至STRING 在線平臺，選擇“Homo Sapiens”, 設置置信度0.4, 構建PPI網(wǎng)絡，下載TSV文件，經(jīng)Cytoscape 3.8.2分析，顯示有563個節(jié)點發(fā)生相互作用，同時產(chǎn)生11 740條邊。通過Cytohubba插件篩選排名前30的關鍵靶點蛋白(圖2), 將其輸入至GEPIA數(shù)據(jù)庫進行驗證，設置|Log2FC|的截斷值為1,P-value的截斷值為0.01, 顯示PTGS2、VEGFA、MMP9等靶點基因在前列腺癌組織與正常組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖2 川龍抑癌湯治療前列腺癌的排名前30的關鍵靶點蛋白

A: PTGS2基因在不同組織中的表達; B: VEGFA基因在不同組織中的表達;C: MMP9基因在不同組織中的表達。紅色*表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 GO功能富集分析

通過Hiplot在線工具對486個靶點進行GO功能富集分析，以P<0.05為篩選標準，獲得GO生物學過程及功能，主要涉及受體活性、轉錄因子活性、酶活性以及生物合成過程調控等方面，列舉生物學功能排名前20的條目，主要是核受體的活動、配體激活的轉錄因子活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、DNA結合轉錄因子結合、蛋白質酪氨酸激酶活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、前列腺素類受體活性、神經(jīng)遞質受體活性等，見圖4。

圖4 關鍵靶點的GO功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路富集分析

通過Hiplot在線工具對486個靶點進行KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選標準，經(jīng)校正排序后對位于前20的細胞信號通路進行氣泡圖展示(圖5)，川龍抑癌湯治療前列腺癌的主要細胞信號通路包括癌癥蛋白聚糖通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、C型凝集素受體信號通路、缺氧誘導因子1(HIF-1)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、程序性細胞死亡蛋白-1/程序性死亡配體-1(PD-1/PD-L1)通路以及前列腺癌等癌癥通路。

圖5 關鍵靶點的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對接結果

運用分子對接技術將主要成分槲皮素、β-谷甾醇、姜黃素與關鍵靶點蛋白MMP9、PTGS2、VEGFA分別進行分子對接，結果顯示，槲皮素、β-谷甾醇、姜黃素均與關鍵靶點有較好的結合性，見表2。以姜黃素為例，其分子對接圖見圖6。

圖6 姜黃素與MMP9、PTGS2、VEGFA靶點蛋白的分子對接示意圖

表2 川龍抑癌湯主要活性成分與關鍵靶點蛋白的分子對接結果 kcal/mol

3 討 論

目前，前列腺癌正成為影響中國老年男性健康的重要疾病之一，且發(fā)病率仍在上升[14]。川龍抑癌湯方中的靈芝孢子為君藥可扶正益氣，靈芝孢子中的三萜類及多糖類等成分具有明顯的免疫調節(jié)作用，可增強患者免疫力，發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。川足、地龍共為臣藥攻毒通絡，并可助靈芝扶益正氣，對腫瘤增殖具有明顯抑制作用[16]。三七、紅花、莪術、大青葉共為佐藥，具有活血散瘀解毒之功。三七總皂苷具有抑制腫瘤細胞信號傳導等抗腫瘤作用[17]; 紅花中的活性成分紅花多糖可通過增強巨噬細胞吞噬能力等作用調節(jié)免疫系統(tǒng)[18]; 莪術醇是莪術中的重要藥效物質，可通過多種作用機制抗腫瘤，如抑制原癌基因、抑制腫瘤細胞核酸合成等[19]。川龍抑癌湯全方用藥符合現(xiàn)代藥理學研究結果，兼顧標本，共奏益氣扶正解毒之功效，符合前列腺癌正氣虛損，膀胱氣化不利，瘀毒阻絡的病機。呂水林等[20]研究發(fā)現(xiàn)，川龍抑癌湯聯(lián)合前列腺綠激光切除術治療前列腺癌與單純手術治療相比，可減輕患者相關臨床癥狀，提高患者生存質量。

本研究結果顯示，川龍抑癌湯中有效活性成分共149個，對應靶點575個，其中與前列腺癌相關的共同作用靶點486個，通過網(wǎng)絡圖發(fā)現(xiàn)姜黃素、β-谷甾醇、槲皮素、亞油酸、DHC等是川龍抑癌湯治療前列腺癌的主要活性成分。姜黃素作為天然化合物，具有良好的抗癌、抗炎特性，但存在一定缺陷，如低吸收與代謝快等, RUTZ J等[21]發(fā)現(xiàn)小劑量姜黃素聯(lián)合光照能顯著增強對體外前列腺癌細胞增殖、遷移的抑制作用。PAN L等[22]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過調控miR-30a-5p/PCLAF軸抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲。AWAD A B等[23]發(fā)現(xiàn), β-谷甾醇通過增加活性氧(ROS)和基礎前列腺素的釋放促使人前列腺癌PC-3細胞凋亡來抑制腫瘤生長。槲皮素是一種生物黃酮，在抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和促進凋亡、逆轉前列腺癌耐藥性方面均有顯著效果[24]。共軛亞油酸(CLA)是亞油酸的異構體混合物，可通過內質途徑、核途徑等多方面抑制腫瘤細胞的生長與增殖[25], 如CLA拮抗前列腺素過氧化物合成酶的轉化，影響前列腺素合成，從而促進前列腺癌細胞凋亡。DHC是辣椒素的主要成分之一，對多種惡性腫瘤如乳腺癌、結直腸癌等均有一定抗癌作用, SHI S M等[26]發(fā)現(xiàn)經(jīng)DHC處理后的黑色素瘤A375和MV3細胞株，通過下調β-Catenin表達表現(xiàn)出對黑色素瘤細胞的顯著抑制作用。

本研究PPI網(wǎng)絡顯示，川龍抑癌湯治療前列腺癌的關鍵靶點包括蛋白激酶(AKT1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、TNF、白細胞介素-6(IL-6)、MMP9、細胞腫瘤抗原基因(TP53)、PTGS2、VEGFA等，排名前30的靶點經(jīng)GEPIA數(shù)據(jù)庫驗證顯示,MMP9、PTGS2、VEGFA在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。MMP9是一種蛋白酶，在前列腺癌、乳腺癌、肝癌等多種癌癥中均過度表達，在細胞遷移、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮抗腫瘤作用[27]。研究[28]表明, L-茶氨酸通過下調MMP9抑制前列腺癌的轉移。TONG W H等[29]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過激活5′-磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)顯著降低MMP9、p65等的表達，從而抑制結腸癌細胞的遷移與侵襲。PTGS2是前列腺素生物合成中的關鍵酶, ZHANG Z L等[30]發(fā)現(xiàn) miR-124-3p通過滅活PTGS2 抑制蛋白激酶/核因子κB(AKT/NF-κB)通路，促進前列腺癌細胞凋亡并抑制其增殖與侵襲。MU H Q等[31]研究發(fā)現(xiàn), VEGFA通過與miR-130b/TNF-α/NF-κB信號通路之間的負反饋循環(huán)衰減前列腺癌細胞中的miR-130b表達，從而促進前列腺癌的血管生成。LIU Y等[32]發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過下調VEGFA、MMP9等蛋白水平抑制膠質母細胞瘤細胞遷移和血管生成。

本研究通過GO功能分析和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，潛在活性靶點參與多種生物學過程來促進前列腺細胞凋亡，抑制前列腺癌細胞增殖與侵襲，主要包括癌癥蛋白聚糖通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、PD-L1通路以及癌癥通路等。研究[33]發(fā)現(xiàn)，AGE與RAGE結合后激活PI3K/AKT信號通路，可能通過調控視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白促進前列腺癌細胞增殖。HIF-1信號通路在多種腫瘤發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用, SONG J K等[34]分析HIF-1信號通路，對免疫基因組前列腺癌子集進行分類研究，發(fā)現(xiàn)HIF-1_H可被定義為早期前列腺癌標志物，對前列腺癌的治療及預后均有潛在臨床意義。IL-17是一種促炎細胞因子，可促進血管生成和腫瘤細胞遷移，也能促進免疫應答發(fā)揮抑制腫瘤作用，其在前列腺癌組織中的表達水平顯著高于正常組織[35]。多項研究[36-37]表明, PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L1免疫治療在多種腫瘤治療中發(fā)揮重要作用, PD-L1與Gleason評分密切相關，提示其可能與前列腺癌的發(fā)展有一定聯(lián)系，但還需進一步開展相關臨床試驗進行驗證。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法分析川龍抑癌湯治療前列腺癌的潛在活性成分、作用靶點及機制，盡管存在一定局限性(例如未對前列腺癌進行中醫(yī)辨證分型，未明確藥物劑量，對動物藥成分的檢索可能不夠全面)，但從整體上分析了潛在靶點并探索了可能的作用機制，為后續(xù)的分子生物學實驗設計及更深層次的藥理學探索奠定了一定基礎。