蟲草素通過抑制氧化應激和炎癥反應對骨折愈合的影響研究*

劉立柱 ，李超藝 ，林詩煒 ，曲野 ，許海軍

（1.海南醫學院第二附屬醫院創傷外科，海口 570311；2.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院，海口 571199）

骨折是臨床上患者最常遇到的創傷性損傷[1]。盡管骨骼具有自我更新的能力，但仍有約10%～20%的骨折導致愈合延遲[2]。因此，迫切需要開發新的治療策略以促進骨折后骨組織的再生。骨折愈合是一個多階段的生物過程，包括初始的炎癥反應，隨后形成軟骨痂，然后形成硬骨痂及骨骼組織的最終重塑。骨折愈合再生受生長因子、激素、趨化因子和細胞因子以及許多其他調節劑的精確控制[3-4]。

蟲草素是傳統中草藥冬蟲夏草的主要活性成分之一，是一種腺苷衍生物，具有抗病毒、抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種活性[5-7]。蟲草素可以抑制人關節炎軟骨細胞中白細胞介素-1β（IL-1β）誘導的炎癥介質表達[8]。另外，蟲草素可以緩解碘乙酸單鈉和手術引起的關節炎大鼠軟骨損傷[9]。蟲草素促進氧化應激誘導的成骨細胞分化，并促進骨形成[10]。蟲草素在閉合性股骨骨折大鼠模型中通過缺氧促進骨髓間充質干細胞（BMMSC）的成骨分化并加速骨折愈合。上述均說明蟲草素對骨損傷具有保護作用，但蟲草素對骨折愈合的作用機制尚未闡明，因此，本研究探究了蟲草素對骨折愈合的作用及相關調節機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與給藥 50只SPF級SD大鼠（購自海南醫學院實驗動物中心），體質量240～270 g，隨機分為假手術組（Sham組）、模型組、蟲草素2.5 mg/kg、蟲草素5 mg/kg、蟲草素10 mg/kg，每組 10只大鼠。根據之前文獻所述稍作調整[10]，手術后腹腔注射給藥不同劑量的蟲草素，Sham組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，連續給藥10周，麻醉大鼠，取材。

1.2 骨折模型大鼠制備 本研究參考之前文獻描述[11]，采用標準的大鼠閉合性股骨橫行骨折內固定模型，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，將大鼠局部脫毛，碘伏消毒，大鼠膝蓋內側用18號針頭于切口處打一個孔，然后將直徑為1.2 mm的AK線插入右股骨髓腔，使用三點彎曲裝置和500 g金屬鈍刀片從35 cm的高度掉落，于縫合切口后在右股骨中軸產生閉合骨折。Sham組的大鼠，將手術切口縫合回去而不會造成骨折，連續4 d肌肉注射抗生素（氨芐青霉素，4×104U/d）。

1.3 材料 骨源性堿性磷酸酶（BAP）試劑盒、核因子-κB受體激活因子（RANKL）試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒、丙二醛測定（MDA）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）大鼠酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自達科為生物技術有限公司。

1.4 放射學檢測 采用微型 CT掃描儀（Micro-CT）（SkyScan，Kontich，比利時）分析大鼠股骨結構，分辨率為18 μm。掃描系統于350 ms內以70 kV，851A和1 000個/180°投影校準。采用CT Analyzer V 1.11軟件（SkyScan）提取橫截面僅包含松質骨的目標體積（VOI），用于形態分析。VOI從生長板的下端1 mm開始，向遠側延伸110個橫截面（高2 mm）。3D分析松質骨的每個VOI骨微結構參數，包括骨體積分數（BV/TV），骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數（Tb.N）和骨密度（BMD）。

1.5 氧化應激和骨代謝分子檢測 采用商用融合檢測試劑盒檢測組織和血清中氧化應激和骨代謝分子的水平。收集液氮冷凍的骨組織，組織研磨儀勻漿處理，然后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）超聲勻漿，1 000 rpm/min，離心半徑 20 cm，4℃離心 10 min，收集上清，保存于-80℃或根據試劑盒說明書檢測氧化應激和骨代謝分子的含量。

1.6 組織病理學檢測 收集病灶中心附近的股骨組織（見圖1A），置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后置于乙二胺四乙酸（EDTA，15%）脫鈣3周，每3 d換一次，然后石蠟包埋，用石蠟切片機切成5 μm薄片。根據制造商說明書分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色、番紅固綠染色和馬松染色，采用顯微鏡觀察并拍照。

1.7 促炎細胞因子檢測 采用ELISA試劑盒檢測血清促炎細胞因子的含量。大鼠眼球取血，室溫靜置30 min，1 000 rpm/min，離心半徑 20 cm，離心 10 min，取上清液，根據制造商說明書檢測大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.8 統計學分析 所有數據均采用GraphPad Prism 5.0軟件分析，結果用均數±標準差（±s）表示，多組數據的比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為具有統計學差異。

2 結果

2.1 蟲草素對骨折大鼠股骨放射學參數的影響 采用Micro-CT分析骨折大鼠股骨的愈合情況，并用Tb.Th，BV/TV，BMD，和Tb.N定量分析。股骨圖像表明與Sham組相比，術后10周模型組骨折大鼠的股骨有明顯的愈傷組織，骨皮質厚度和骨量減少，小梁骨微結構明顯受損，給予蟲草素治療組大鼠的骨折部位明顯愈合，骨微結構損傷和骨皮質厚度及骨量明顯改善恢復（見圖1A）。與Sham組比較，模型 組 大鼠Tb.Th，BV/TV，BMD，和Tb.N均明顯降低（P<0.05），蟲草素5 mg/kg和10 mg/kg組 較模型組和蟲草素2.5 mg/kg組大鼠的Tb.Th，BV/TV，BMD，和Tb.N顯著增加（P<0.05），但蟲草素5 mg/kg和10 mg/kg組差異無統計學意義（P>0.05）（見圖1B-E），這些結果均表明蟲草素能夠促進大鼠骨折愈合，并改善骨折大鼠的骨微結構參數變化和損傷。

圖1 蟲草素對骨折大鼠股骨放射學參數的影響Fig.1 Effect of cordycepin on radiological parameters of femur in fractured rats

2.2 蟲草素對骨折大鼠骨代謝分子的影響 骨代謝分子檢測結果顯示，與Sham組比，模型組大鼠股骨組織中BAP、RANKL和TRAP含量均顯著增加（P<0.05）。蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組較模型組和2.5 mg/kg組大鼠明顯降低了BAP和TRAP的含量（P<0.05），蟲草素 2.5 mg/kg組 、5 mg/kg組 和10 mg/kg組較模型組大鼠RANKL的含量呈劑量依賴性降低（P<0.05），同時，蟲草素10 mg/kg組較5 mg/kg組大鼠BAP和TRAP的含量明顯降低（P<0.05），見圖2A，2B和C，上述結果表明蟲草素可以直接調節骨折大鼠骨再生和骨折愈合過程。

圖2 蟲草素對骨折大鼠骨代謝分子的影響Fig.2 The effect of cordycepin on bone metabolism molecules in fractured rats

2.3 蟲草素對骨折大鼠股骨病理學的影響 HE染色結果顯示，模型組和蟲草素2.5 mg/kg組觀察到排列疏松的大量編織骨，蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組觀察到縱向排列整齊的板層狀骨，且編織骨減少。番紅固綠染色結果顯示，觀察模型組和蟲草素2.5 mg/kg組大鼠出現大量的軟骨組織（紅色），蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組大鼠觀察到軟骨組織減少，成骨組織（綠色）增加。馬松染色結果顯示，蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組觀察到大量的成熟骨組織（見圖3）。上述結果表明蟲草素對骨折大鼠的股骨的骨折愈合過程具有潛在的促進作用。

圖3 蟲草素對骨折大鼠股骨病理學的影響Fig.3 The effect of cordycepin on the pathology of femur in fractured rats

2.4 蟲草素對骨折大鼠炎癥反應的影響 與Sham組比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量顯著增加（P<0.05）。蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組較模型組和2.5 mg/kg組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯降低（P<0.05），蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組差異無統計學意義（P>0.05）（見圖4A，4B和C），上述結果表明蟲草素對骨折大鼠的炎癥反應具有潛在調節作用。

圖4 蟲草素對骨折大鼠炎癥反應的影響Fig.4 The effect of cordycepin on inflammatory response in fractured rats

2.5 蟲草素對骨折大鼠氧化應激的影響 結果顯示與Sham組比，模型組大鼠血清MDA含量及組織中MDA和CAT的含量顯著增加（P<0.05）。蟲草素2.5 mg/kg組、5 mg/kg組和10 mg/kg組較模型組大鼠血清MDA含量及組織中MDA和CAT的含量呈劑量依賴性降低（P<0.05）。與蟲草素2.5 mg/kg組和5mg/kg組比較，蟲草素10mg/kg組大鼠血清MDA含量及組織中MDA和CAT的含量明顯降低（P<0.05）（見圖5A，5B和5C），結果表明蟲草素對骨折大鼠的氧化應激具有潛在調節作用。

圖5 蟲草素對骨折大鼠氧化應激的影響Fig.5 Effect of cordycepin on oxidative stress in fractured rats

3 討論

蟲草素是一種中藥活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等廣泛的生物學活性，并且可以調節成骨細胞分化，對骨組織損傷具有保護活性。本研究發現蟲草素加速了大鼠骨折的愈合，改善了骨微結構和骨代謝分子，同時抑制了炎癥反應和氧化應激，是一種促進骨折愈合的潛在先導化合物。

本研究采用標準的大鼠閉合性股骨骨折內固定模型評價蟲草素對骨折愈合的作用。此模型用SD大鼠造模，可以更好的模擬臨床人類愈合癥狀，并類似患者疾病模式。骨折愈合過程復雜，主要包括初期的血腫急性炎癥期、原始骨痂形成期和骨板形成塑形期。血腫形成的半剛性纖維軟骨痂給早期的骨折愈合提供了初始穩定性。本研究放射學檢測結果蟲草素治療組大鼠的骨折部位明顯愈合，并且Tb.Th，BV/TV，BMD，和 Tb.N顯著增加。同時，組 織病理學結果表明模型組大鼠觀察到排列疏松的編織骨和大量軟骨組織，蟲草素組大鼠觀察到縱向排列整齊的板層狀骨，這些結果表明蟲草素能夠促進大鼠骨折愈合，并改善骨折大鼠的骨微結構參數變化和受損，對骨折愈合具有治療作用。

研究表明蟲草素可以緩解大鼠的氧化應激反應[12]。同樣的，本研究結果表明蟲草素能夠顯著減少骨折大鼠血清MDA含量及組織中MDA和CAT的含量，抑制大鼠的氧化應激反應。氧化應激級聯會導致骨折部位的骨再生抑制，骨再生對骨折正常愈合是必需的。破骨細胞和成骨細胞之間的平衡對骨丟失和骨形成至關重要[13]。TRAP和RANKL是破骨細胞成熟的標志，本研究表明骨折大鼠骨組織中TRAP和RANKL的含量顯著增加，給予蟲草素治療能夠顯著減少大鼠骨組織中TRAP和RANKL的含量。上述研究結果表明蟲草素對骨折愈合的促進過程與調節氧化應激有關。

骨折愈合最早始于炎癥反應過程，促炎細胞因子在組織愈合過程起著至關重要的作用[14-15]。促炎細胞因子包括IL-1β、TNF-α和IL-6對骨折愈合具有重要調節作用[16]。骨折愈合不僅僅是破骨細胞和成骨細胞之間的平衡作用，也是不同促炎細胞因子間的相互調節過程。研究表明骨折初期血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量顯著增加，后續逐漸下降[17]。其中TNF-α作為炎癥反應初期的主要細胞因子，其能夠通NF-κB信號通路和OPG/RANKL/RANK信號通路介導骨相關細胞細胞的凋亡過程，并且促進破骨細胞增殖和活化。除此之外，IL-1β和IL-6能夠與TNF-α發生協同作用，能夠促進軟骨細胞增殖和活化，并介導氧化應激反應[18]。本研究結果表明骨折大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量顯著增加，給予蟲草素治療顯著減少骨折大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。結果表明蟲草素對骨折愈合的促進過程與調節炎癥反應有關。

綜上，本研究表明蟲草素能夠促進骨折愈合，并且與抑制氧化應激和炎癥反應有關。但是，蟲草素的具體調節信號通路仍需后續研究進一步探索。