支鏈氨基酸代謝在糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素產(chǎn)量提高與組分優(yōu)化中的應(yīng)用

李輝 方志鍇 郭霞凌 江紅,*

(1 大邦(湖南)生物制藥有限公司，長沙 410221；2 福建省微生物研究所，福州 350007)

自青霉素1941年應(yīng)用于臨床以來，人類已發(fā)現(xiàn)了上萬種抗生素，其中臨床上常用的抗生素有數(shù)百種。抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，改變了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)程，為人類感染性疾病的防治做出了重要貢獻(xiàn)。隨著抗生素的廣泛使用，病原菌對抗生素的耐藥性不斷增強(qiáng)，抗生素耐藥性已成為一個嚴(yán)峻的全球性公共衛(wèi)生問題[1]。開發(fā)能夠有效抑制多重耐藥菌的新型抗生素迫在眉睫，但新型抗生素的開發(fā)非常困難，近30年來人類在新型抗生素的研制方面基本沒有突破性發(fā)現(xiàn)。許多老品種抗生素仍然是對抗導(dǎo)致許多疾病的病原菌的最佳武器，在今后幾十年內(nèi)它們的臨床地位不會有所改變。

在抗生素武器庫中，糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素在治療耐藥菌感染疾病中具有不可替代的作用。糖肽類抗生素是通過非核糖體肽合成的一類抗生素，一般由7個氨基酸組成的環(huán)肽母核與2～7糖殘基以糖苷鍵相連接而成，大部分糖肽類抗生素糖基位置含有酰基脂肪酸鏈[2]。目前臨床上使用的糖肽類抗生素有萬古霉素、替考拉寧、達(dá)巴萬星、特拉萬星等[3-4]，主要用于治療包括MRSA在內(nèi)的革蘭陽性菌感染，其中萬古霉素曾被譽(yù)為治療耐藥革蘭陽性菌的最后一道防線[5]。環(huán)脂肽類抗生素是由酰基脂肪酸側(cè)鏈和環(huán)肽母核通過1～3個氨基酸組成的線性肽連接構(gòu)成的一類抗生素，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及真菌具有高效廣譜的殺菌作用[6-7]。環(huán)脂肽多黏菌素B是人類抵御多重耐藥革蘭陰性細(xì)菌的最后一道防線[8]，達(dá)托霉素對MRSA、VRSA、VRE和PRSP等高致病革蘭陽性臨床耐藥菌株具有很好的殺菌作用，被譽(yù)為“超級抗生素”[9-10]，環(huán)脂肽棘白菌素類抗生素卡泊芬凈、米卡芬凈等用于侵襲性真菌感染的預(yù)防和治療效果顯著[11]。

大部分糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素均含有疏水性酰基脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)，可使其親脂性增強(qiáng)，更容易與病原菌細(xì)胞膜磷脂層結(jié)合，從而決定了它們具有良好的抗菌效果。酰基脂肪酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)差異對這兩類抗生素的理化性質(zhì)、抗菌活性和細(xì)胞毒性影響顯著，因此定向改造或強(qiáng)化含特定脂肪酸鏈組分的糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素對于進(jìn)一步開發(fā)它們的臨床應(yīng)用具有重要價值。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，許多糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素的生物合成途徑與調(diào)控機(jī)制已經(jīng)闡明[12-14]，為利用遺傳代謝工程針對酰基脂肪酸側(cè)鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造奠定了基礎(chǔ)。本文從糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素酰基脂肪酸側(cè)鏈的生源途徑、外源添加支鏈氨基酸組分和內(nèi)部改造支鏈氨基酸代謝途徑實(shí)現(xiàn)對這兩類抗生素酰基脂肪酸側(cè)鏈的組分優(yōu)化方面進(jìn)行了系統(tǒng)闡述，以期為這兩類抗生素的產(chǎn)量提高與組分優(yōu)化提供理論參考和技術(shù)支撐。

1 糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素中酰基脂肪酸側(cè)鏈的生源途徑

達(dá)托霉素是從玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)發(fā)酵產(chǎn)生的環(huán)脂肽類抗生素A21978C混合物中分離出的最小組分，A21978C系列混合物母核結(jié)構(gòu)完全一樣，不同組分僅在酰基脂肪酸側(cè)鏈有所不同，達(dá)托霉素脂酰基側(cè)鏈為正癸酰基，A21978C1-C3 3個主要組分的側(cè)鏈分別為反異十一烷酰基、異十二烷酰基和反異十三烷酰基[15]，見圖1。脂酰基側(cè)鏈對于A21978C的抗菌活性是必須的，A21978C抗菌活性隨碳鏈增長而增加(直到C10)，但碳鏈長度超過C11時細(xì)胞毒性顯著增加，綜合考慮各組分的抗菌活性與細(xì)胞毒性，獲得的最佳組分是含有十碳癸酰基的達(dá)托霉素。在脂肪酸側(cè)鏈合成方面，達(dá)托霉素生物合成基因簇中并沒有發(fā)現(xiàn)專門負(fù)責(zé)脂肪酸合成的基因[16]，脂肪酸側(cè)鏈來源于細(xì)胞初級代謝的脂肪酸合成途徑。達(dá)托霉素與A21978C1-C3的脂酰基側(cè)鏈生源途徑完全不同，達(dá)托霉素的正癸酰基側(cè)鏈來源于細(xì)胞內(nèi)的直鏈脂肪酸，直鏈脂肪酸的合成前體來源于葡萄糖、脂肪和部分氨基酸分解代謝產(chǎn)生的乙酰CoA[17]，而在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中達(dá)托霉素癸酰基側(cè)鏈則主要來源于體外喂養(yǎng)的正癸酸。A21978C1-C3的酰基側(cè)鏈合成前體來源于支鏈氨基酸分解代謝產(chǎn)生的脂酰CoA，其中酸纈氨酸在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和支鏈α酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化下形成異丁酰CoA，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成途徑生成A21978C2側(cè)鏈前體異十二烷酸，異亮氨酸則在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和支鏈α酮酸脫氫酶復(fù)合體的作用下轉(zhuǎn)化為α-甲基丁酰CoA，通過細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成途徑生成A21978C1和A21978C3的側(cè)鏈前體反異十一烷酸和反異十三烷酸[18]。

達(dá)巴萬星是繼萬古霉素和替考拉寧之后的抗多重耐藥革蘭陽性菌新型半合成糖肽類抗生素，其前體A40926由野野村放線菌Nonomuraeasp.ATCC39727產(chǎn)生。A40926為一組結(jié)構(gòu)相近的化合物組成的復(fù)合物，各化合物均含有交聯(lián)七肽架構(gòu)、兩個氯原子、一個甘露糖和一個脂肪酸側(cè)鏈，區(qū)別僅在于疏水性酰基脂肪酸鏈不同，其中組分B0和A0的脂酰基側(cè)鏈分別為異十二烷基和異十一烷基，而組分B1和A1的脂酰基側(cè)鏈則分別為正十二烷基和正十一烷基[19-20]，見圖2。研究表明，脂酰側(cè)鏈與A40926的抑菌活性有關(guān)，然而在A40926生物合成基因簇亦不含參與脂酰長鏈合成的相關(guān)基因[21]，脂肪酸側(cè)鏈可能來源于細(xì)胞初級代謝的脂肪酸合成途徑。Jovetic等[22]研究發(fā)現(xiàn)，A40926各組分的比例與其產(chǎn)生菌Nonomuraeasp.ATCC39727細(xì)胞脂肪酸組成在量上存在一致性，由此推測可能是細(xì)胞長鏈脂肪酸經(jīng)β-氧化后生成A40926各化合物的脂肪酸鏈，而支鏈氨基酸則作為細(xì)胞脂肪酸合成的前體物間接參與了A40926的生物合成。張廣昊等[23]也證明了Nonomuraeasp.ATCC39727細(xì)胞脂肪酸和A40926化合物的脂側(cè)鏈之間存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。

紐莫康定B0是由絲狀真菌Glarea lozoyensis通過NRPS-PKS雜合途徑生成的一種環(huán)脂肽抗生素，其半合成衍生物卡泊芬凈是第一個用于治療人類侵入性真菌感染的的棘白素類抗真菌藥物。紐莫康定B0由一個核心結(jié)構(gòu)環(huán)狀六肽母核和一個十六碳的脂肪酸側(cè)鏈組成，非核糖體肽基因簇GLNRPS4和聚酮基因簇GLPKS4分別負(fù)責(zé)環(huán)狀六肽母核和十六碳脂肪酸鏈的生物合成[24-25]。G.lozoyensis除能合成主產(chǎn)物B0外，還能產(chǎn)生A0，C0等一系列十多種類似物，它們與B0的區(qū)別體現(xiàn)在氨基酸側(cè)鏈的不同修飾上，但其脂肪酸側(cè)鏈均為10, 12-二甲基肉豆蔻酸。肉豆蔻酸由GLPKS4編碼的聚酮合酶縮合乙酰CoA而成，并非來自于細(xì)胞初級代謝的脂肪酸合成途徑和外源喂養(yǎng)途徑[25-26]。

2 外源添加支鏈氨基酸對糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素產(chǎn)量和組分的影響

替考拉寧是由替考游動放線菌(Actinoplanes teichomyceticus)產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素，結(jié)構(gòu)中含有7個氨基酸、3個糖基和1個脂酰基側(cè)鏈。替考拉寧由五個結(jié)構(gòu)相似的化合物TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4和TA2-5組成，差異僅表現(xiàn)在脂酰基側(cè)鏈的不同，但都是替考拉寧的有效組分，其中TA2-2為主要組分[27]，圖3。亞油酸和油酸分別是TA2-1和TA2-3線性脂肪酸側(cè)鏈的合成前體，L-纈氨酸是TA2-2脂肪酸側(cè)鏈8-甲基壬酸的合成前體，亮氨酸和異亮氨酸則分別是TA2-4和TA2-5的脂肪酸側(cè)鏈的合成前體[28-29]。王明蓉等[30]報(bào)道在替考拉寧發(fā)酵過程中添加0.06%的纈氨酸可顯著提高主要組分TA2-2的含量。王會會等[31]報(bào)道在替考拉寧生物合成過程中添加0.06%的纈氨酸和0.75%的大豆油，替考拉寧產(chǎn)量可提高47.2%，各組分含量均符合質(zhì)量要求，其中主要成分A2-2含量達(dá)到53.1%。

多黏菌素B是由多黏類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)產(chǎn)生的一種堿性環(huán)脂肽類抗生素，是由B1、B1-Ile、B2、B3、B4、B5和B6 7種組分構(gòu)成的混合物，各組分的差異僅在酰基脂肪酸鏈部分的變化和7位氨基酸的不同(亮氨酸或異亮氨酸)[32]，主要組分為B1、B2、B3和B1-Ile，圖4。根據(jù)《中國藥典》種對多黏菌素B的含量限度要求，B3含量不得超過6.0%，B1-Ile含量不得超過15.0%，B1、B2、B3 和B1-Ile總含量不得少于80%[33]。B1和B1-Ile酰基脂肪酸為6-甲基辛酸(MOA)，B2酰基脂肪酸為異辛酸(IOA)，MOA和IOA的合成分別起始于異亮氨酸和纈氨酸的分解代謝。在多黏菌素B生物合成過程中，亮氨酸主要作為前體氨基酸，異亮氨酸的分解代謝產(chǎn)物則主要參與B1脂肪酸側(cè)鏈合成。吳恩國等[34]報(bào)道了在多黏菌素B發(fā)酵過程中添加0.08%的亮氨酸，0.08%異亮氨酸和0.05%苯丙氨酸時，可使主要組分B1在復(fù)合物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上，有效控制和優(yōu)化了多黏菌素B的發(fā)酵組分。

在A40926多組分混合物中，主要組分B0脂肪酸側(cè)鏈酸來源于產(chǎn)生菌細(xì)胞長鏈脂肪酸異十六烷酸的β-氧化降解，而異十六烷酸的合成起始于纈氨酸的分解代謝，因此纈氨酸對A40926的效價和組分有影響顯著。Selva等[35]報(bào)道了在A40926發(fā)酵過程中，添加纈氨酸或異丁醇可選擇性提高B0組分的產(chǎn)量。Beltrametti等[36]報(bào)道了在Nonomuraeasp.ATCC39727基礎(chǔ)培養(yǎng)基P150中加入0.2%的L-纈氨酸，可顯著提高B0因子的濃度和比例，其中B0:B1組分比例從1:1上升至10:1。達(dá)托霉素發(fā)酵過程具有前體導(dǎo)向的特征，即在發(fā)酵過程中添加不同的前體物質(zhì)，可顯著提高A21978C混合物中其相應(yīng)組分的含量，當(dāng)添加纈氨酸時A21978C2組分的含量大幅提高，當(dāng)添加異亮氨酸時A21978C1和A21978C3的含量提高，當(dāng)添加亮氨酸時產(chǎn)生兩種新組分X和Y，而在發(fā)酵過程中添加癸酸時則可以能夠顯著提高達(dá)托霉素產(chǎn)量[37]。

3 內(nèi)部改造支鏈氨基酸代謝途徑對糖肽類和環(huán)脂肪肽類抗生素產(chǎn)量和組分的影響

支鏈脂肪酸的生物合成以支鏈脂酰CoA作為起始單元，而支鏈脂酰CoA由支鏈氨基酸分解代謝產(chǎn)生。

支鏈氨基酸分解代謝首先在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(branched-chain amino acid aminotransferase, BCAT)的作用下經(jīng)可逆的轉(zhuǎn)氨基作用形成相應(yīng)的支鏈-α酮酸，其中纈氨酸生成α-酮異戊酸、亮氨酸生成α-酮異己酸、異亮氨酸生成α-酮基-β-甲基戊酸。支鏈-α酮酸再經(jīng)支鏈α酮酸脫氫酶復(fù)合體(branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex, BCKD)催化進(jìn)行不可逆的氧化脫羧，形成少一個碳原子的支鏈脂酰CoA, 如異丁酰-CoA(Isobutyryl-CoA)、異戊酰-CoA(Isovaleryl-CoA)和2-甲基丁酰CoA(2-methylbutyryl-CoA)[38]。支鏈脂酰CoA再經(jīng)一系列酶的催化作用，在脂酰CoA的α，β原子間脫氫形成雙鍵，在雙鍵間加水形成β-羥酰基CoA等，最終纈氨酸降解為琥珀酰CoA，異亮氨酸降解為丙酰CoA和乙酰CoA，亮氨酸降解為乙酰乙酸和乙酰CoA (圖5)。異丁酰-CoA、異戊酰-CoA和2-甲基丁酰CoA等支鏈脂酰CoA亦可經(jīng)細(xì)胞脂肪酸合成酶系(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)作用生成奇數(shù)碳或偶數(shù)碳支鏈脂肪酸，還可作為很多聚酮類化合物生物合成的重要前體 (圖6)[39]。

BCKD是一種廣泛存在于生物體內(nèi)并參與支鏈氨基酸降解的關(guān)鍵酶，能不可逆催化支鏈-α酮酸氧化脫羧，也是支鏈脂肪酸初步合成的重要酶。BCKD是由脫羧酶(E1，包括E1α、E1β兩個亞單位)、二氫硫辛酰胺酰基轉(zhuǎn)移酶(dihydrolipoyltransacetylase，E2)和二氫硫辛酰胺酰基脫氫酶(dihydrolipoyldehydrogenase，E3)4種功能性組分組成的多酶復(fù)合體，E1α、E1β、E2編碼基因一般成簇地分布在生物體基因組中，而E3編碼基因則分布在基因簇以外的染色體其它區(qū)域。細(xì)菌基因組中通常僅含有一套BCKD編碼基因簇，而鏈霉菌中一般含有兩套BCKD編碼基因簇，其中一套基因簇起主導(dǎo)作用，另一套則起輔助作用或?yàn)槌聊虼亍Ｔ谔焖{(lán)色鏈霉菌S.coelicolor中報(bào)道了兩套BCKD編碼基因簇bkdA1B1C1和bkdA2B2C2，其中bkdA1B1C1在菌絲形態(tài)發(fā)育和抗生素生物合成上發(fā)揮著重要作用，當(dāng)bkdA1B1C1被阻斷后，突變株內(nèi)幾乎不產(chǎn)支鏈脂肪酸且不能在以支鏈氨基酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長[40-41]。I型聚酮化合物阿維菌素的生物合成起始單元由異亮氨酸或纈氨酸降解轉(zhuǎn)化而來，當(dāng)其產(chǎn)生菌S.avermitilis中的BCKD編碼基因簇bkdFGH敲除后，突變株由于起始單元合成能力喪失而失去阿維菌素合成能力，而敲除另一BCKD編碼基因簇bkdABC并不影響阿維菌素的合成。當(dāng)向bkdFGH敲除突變株補(bǔ)加異丁酸或2-甲基丁酸時則又可恢復(fù)阿維菌素合成，而單獨(dú)添加環(huán)己羧酸發(fā)酵后則可產(chǎn)生殺菌活性更強(qiáng)的多拉菌素。說明支鏈氨基酸代謝在S.avermitilis聚酮產(chǎn)物生物合成過程中扮演了提供前體的重要角色[42-43]。

隨著高通量測序和生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素產(chǎn)生菌全基因組序列得以測定和解析，BCKD基因簇作為這兩類抗生素酰基脂肪酸側(cè)鏈生物合成途徑中的重要遺傳因子，在復(fù)雜的代謝與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。對糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素產(chǎn)生菌BCKD基因簇進(jìn)行克隆與功能分析，有助于我們通過菌種基因工程改造以降低產(chǎn)生菌中含支鏈脂肪酸側(cè)鏈的組分的比例，提高含直鏈脂肪酸側(cè)鏈組分的含量。羅帥等[44]通過基因敲除和回補(bǔ)的遺傳手段研究了達(dá)托霉素產(chǎn)生菌S.roseosporus中BCKD基因簇bkdA1B1C1(MG324008)和bkdA2B2C2(MG324007)在達(dá)托霉素同系物A21978C1-C3生物合成中發(fā)揮的具體作用，研究發(fā)現(xiàn)，bkdA1B1C1敲除突株不再生成同系物A21978C1-C3，而bkdA2B2C2敲除突變株A21978C1-C3下降程度并不明顯，說明了S.roseosporus中A21978C1-C3支鏈脂肪酸前體的合成，幾乎全部依賴于bkdA1B1C1主導(dǎo)催化的纈氨酸和異亮氨酸的分解代謝，bkdA2B2C2只是輔助基因簇。進(jìn)一步基于支鏈氨基酸的分解代謝途徑，構(gòu)建了同時敲除bkdA1B1C1/bkdA2B2C2基因簇的工程菌，在不影響達(dá)托霉素發(fā)酵效價的前提下特異性地消除了3個主要同系物副產(chǎn)物A21978C1-C3生成，實(shí)現(xiàn)了達(dá)托霉素的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)。這是基于內(nèi)部支鏈氨基酸代謝途徑改造實(shí)現(xiàn)對環(huán)脂肪肽類抗生素組分優(yōu)化的典型成功案例，可為其他糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素的產(chǎn)生菌種基因工程改造提供重要的參考。

4 結(jié)語與展望

在許多抗生素生物合成過程中，產(chǎn)生菌往往產(chǎn)生以一種組分為主要活性成分的多組分混合物，這種多組分現(xiàn)象給目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化、藥品標(biāo)準(zhǔn)制定和生產(chǎn)質(zhì)量控制帶來很大的困難與挑戰(zhàn)。篩選和構(gòu)建主產(chǎn)單一高活性組分的優(yōu)良生產(chǎn)菌株，對于提高發(fā)酵類抗生素藥品安全性、有效性和標(biāo)準(zhǔn)水平具有十分重要的意義。在糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素中，酰基脂肪酸側(cè)鏈的差異是導(dǎo)致這兩類抗生素多組分現(xiàn)象主要原因，有針對性地強(qiáng)化或定向改造含特定脂肪酸鏈組分的糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素對于促進(jìn)它們的臨床應(yīng)用具有重要價值。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸三種支鏈氨基酸的分解代在糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素酰基脂肪酸側(cè)鏈的生物合成過程中發(fā)揮著重要作用，對這兩類抗生素的發(fā)酵效價高低與發(fā)酵組分差異有著顯著影響。通過向培養(yǎng)基中添加特異性支鏈氨基酸，經(jīng)分解代謝后可為糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素的酰基脂肪酸側(cè)鏈提供更多的脂酰CoA前體，從而促進(jìn)目標(biāo)組分產(chǎn)量與組分的提高。隨著糖肽類和環(huán)脂肽類抗生素生物合成機(jī)制的深入解析及支鏈氨基酸分解代謝有關(guān)基因的克隆與功能鑒定，亦為代謝工程改造內(nèi)部支鏈氨基酸代謝途徑以實(shí)現(xiàn)對這兩類抗生素酰基脂肪酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的定向控制與人工調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。