紐莫康定雜質C0的制備研究

曾凡洲 劉志鈺 朱兵峰 王欽超 張貴民,* 魏榮省

(1 魯南新時代生物技術有限公司，臨沂 273400；2 魯南制藥集團股份有限公司，臨沂 273400；3 哺乳動物細胞高效表達國家工程實驗室，臨沂 273400)

紐莫康定B0(pneumocandin B0)是由真菌Glarea lozoyensis產生的次級代謝產物，是合成抗真菌藥物醋酸卡泊芬凈(caspofungin)的中間體[1-2]。Glarea lozoyensis除能產生B0外，還能產生A0、A1、A2、B0絲氨酸同系物、B1、B2、B5、B5絲氨酸同系物、B6、C0、D0、D2和E0等多種類似物，不同氨基酸側鏈修飾或氨基酸連接順序的不同導致了紐莫康定化合物的結構多樣性[3-4]。其中，紐莫康定C0是B0的同分異構體，為紐莫康定B0生產過程中的關鍵工藝雜質。紐莫康定B0和C0結構式見圖1。兩者結構差別僅在于紅色標注羥基位置的不同。

當今，藥品申報在雜質控制方面越來越嚴格。藥物中含有的雜質會降低療效和影響穩定性，有的甚至對人體健康有害或產生其他不良反應[5]。所以在紐莫康定B0研制過程中，有必要對紐莫康定C0制備出高純度的樣品，為結構鑒定、質量研究及雜質傳遞研究提供物質基礎。制備型高效液相色譜法在藥物雜質研究應用中越來越廣泛[6-7]。本研究以紐莫康定B0中試生產過程中富集的雜質物料為原料，通過高壓制備色譜、濃縮、干燥等處理過程，得到了C0干粉，并對其進行了結構分析和確證，開發出了一種操作方便、成品純度高、便于長期保存的制備工藝。

1 主要儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent公司)；Csprep150工業制備色譜系統(漢邦科技)；DN50制備色譜系統(北京澳諾科技有限公司)；R-1001N型旋轉蒸發儀(鄭州長城科工貿有限公司)；SHB-B95型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；DHJK-2020低溫冷卻循環泵(鄭州科泰實驗設備有限公司)；SCIENTZ-12ND冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；熱重分析儀，TG209F3(德國耐馳)；UV-2600紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu)；Scientific Nicolet iS 10紅外光譜儀(美國Thermo)；INOVA-600核磁共振波譜儀(Varian公司)；Agilent 1200RRLC-6520 Accurate-Mass Q-Tof質譜儀(Agilent公司)。

紐莫康定發酵液(魯南制藥集團股份有限公司)；工業級二氯甲烷(山東金嶺化工股份有限公司)；工業甲醇(兗礦國宏化工有限責任公司)；制備級乙腈(濰坊中匯化工有限公司)；改性硅膠(蘇州納微科技股份有限公司)；UniSil ? Hilic 2M硅膠色譜填料(蘇州納微科技有限公司)；紐莫康定C0對照品(大同市礦區風華生物科技有限公司)，含量95.11%，批號16002；HPLC用乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定紐莫康定C0

線性洗脫程序如表1所示。Welch Ultimate HILIC Amide柱，4.6 mm×250 mm，3.5 μm；波長220 nm，流量1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40℃，流動相A為水，流動相B為乙腈。

表1 線性洗脫程序Tab.1 Linear elution procedure

2.2 紐莫康定C0的富集

2.2.1 粗品的制備

紐莫康定粗品以魯南制藥集團股份有限公司專利方法制得[2]。具體如下：將經真菌Glarea lozoyensis發酵得到的含有紐莫康定B0的中試發酵液3000 L(發酵效價為675 mg/L)在攪拌的狀態下，用磷酸調節pH值4.2，加入2%的助濾劑硅藻土，混勻，靜置0.5 h，過濾，得到固體菌渣。菌渣用2倍95%乙醇浸提，過濾去除菌絲，得浸提液；調整浸提液的醇濃度至20(V/V)。將其以0.5～1.0 BV/h的速度流經D101柱，依次用純化水、30%(V/V)乙醇-水溶液沖洗樹脂柱，然后用80%(V/V)乙醇-水溶液洗脫樹脂柱，收集富含紐莫康定B0的洗脫液。在洗脫液中加入0.5%活性炭，在20℃條件下攪拌30 min，過濾脫色。脫色液經過超濾過濾后，加水稀釋至30%(V/V)。以0.5～1.0 BV/h的速度流經KB-SPE-HLB柱，用含乙醇30%(V/V)溶液沖洗樹脂柱，再用乙醇80%(V/V)溶液洗脫，收集富含紐莫康定B0的洗脫液。將收集到的紐莫康定B0洗脫液，在30℃條件下真空濃縮，得到紐莫康定B0粗品1.30 kg。經HPLC檢測，粗品中C0的表觀含量為8.78%。

2.2.2 高壓液相色譜富集

在Cs-prep150工業制備色譜系統中，以動態軸向壓縮技術裝柱3 kg改性硅膠。將紐莫康定B0粗品用甲醇、二氯甲烷混合溶液[V(甲醇):V(二氯甲烷)=1:4]溶解，即為上樣液。流動相為V[二氯甲烷(工業)]:V(甲醇):V(水)=42:9:1；上樣量為11.4 g粗品；洗脫流量為480 mL/min；檢測波長設置為276和210 nm。高壓液相色譜富集在線圖譜見圖2。對其分段進行收集，經HPLC檢測，圖2方框標注部分(RT 91.23～102.50 min)即為紐莫康定C0出峰位置。

對紐莫康定粗品連續上樣，收集紐莫康定C0富集液。將紐莫康定C0雜質富集液進行減壓濃縮，40℃水浴，-0.090 MPa以下真空，蒸至無冷凝液流出時，加乙醇，繼續濃縮。直至濃縮液變成干粉，小心刮出雜質干粉。經HPLC檢測，其紐莫康定C0色譜純度為78.53 %。

2.3 紐莫康定C0的高壓液相色譜制備

參考楊淵等[8]在親水作用色譜法測定紐莫康定B0及其雜質的研究中的實驗結果，本實驗在DN50制備色譜系統中，以動態軸向壓縮技術裝柱UniSil?Hilic 2M硅膠色譜填料300 g。在親水作用色譜(HILIC)模式進行色譜制備。上樣液配制：每1.0 g雜質干粉溶至70 mL甲醇中，0.45 μm尼龍66有機膜過濾。進樣量：5 mL。流速：120 mL/min。波長：278 nm。制備洗脫程序見表2。

表2 紐莫康定C0的制備洗脫程序Tab.2 Elution procedure for the preparation of pneumocandin C0

在線圖譜見圖3。根據出峰分段收集。結合HPLC檢測，確定下圖所示方框標注部分(tR為41.41～44.26 min)為紐莫康定C0。

連續進樣，合并收集液。然后對合并液在40℃水浴，-0.090 MPa以下真空，進行減壓濃縮。對濃縮液按照表3程序進行冷凍干燥。得到雜質紐莫康定C0干粉1.7395 g。經檢測，紐莫康定C0色譜純度99.19 %，峰純度999.4(DAD檢測器)，熱重3.05 %。HPLC圖譜見圖4。

表3 紐莫康定C0的凍干程序Tab.3 Feeze-drying procedure for pneumocandin C0

2.4 結構鑒定[9-12]

為進一步確定本研究制備所得凍干粉為紐莫康定C0，對其分別進行了質譜(MS)、紫外吸收光譜(UV)、紅外吸收光譜(IS)、核磁共振譜(1H-NMR、13C-NMR)分析。

2.4.1 質譜

測試條件為ESI(+)。分子離子峰及歸屬見表4。結果表明：質譜測得本品的加合離子峰[M+H]+，其質荷比為m/z1065.6，推定其相對分子質量為1064.6，與紐莫康定C0的相對分子質量一致。

表4 紐莫康定C0凍干粉的加合離子峰及歸屬Tab.4 Molecular ion peaks and attribution of freeze-dried powder for pneumocandin C0

2.4.2 紅外吸收光譜

測試條件：KBr壓片。紐莫康定C0凍干粉樣品的IR譜見圖5，各吸收峰歸屬見表5。對紅外吸收光譜的解析如下：

表5 紐莫康定C0凍干粉的IR譜各吸收峰歸屬Tab.5 Assignment of IR absorption peaks of freeze-dried powder for pneumocandin C0

(1)3349 cm-1為羥基中O-H的伸縮振動吸收，1082 cm-1為羥基中的C-O伸縮振動吸收，說明化合物中含有羥基結構；

(2)3349 cm-1為羥基中N-H的伸縮振動吸收，1237 cm-1為羥基中的C-N伸縮振動吸收，說明化合物中含有氨基結構；

(3)2955 cm-1為甲基的C-H伸縮振動吸收，說明化合物中含有甲基結構；

(4)1655 cm-1為羰基的C=O伸縮振動吸收，說明化合物中含有羰基結構；

(5)1536 cm-1，1517 cm-1，1439 cm-1為苯環骨架伸縮振動吸收，842 cm-1為苯環=C-H的彎曲振動吸收，說明化合物中含有苯環結構。

解析結果表明：該樣品的紅外光譜圖特征與目標化合物的化學結構基本相符合。

2.4.3 核磁共振譜

測試條件：溶劑CD3OD。內標：δTMS0。分析序號見圖6。

(1)1H核磁共振譜(1H-NMR)

本研究對紐莫康定C0凍干粉樣品進行了1H譜和1H-1H相關譜(gCOSY)測試。測定數據見表6。根據gCOSY譜，結合gHMQC譜和DEPT譜，可對紐莫康定C0凍干粉的1H譜進行歸屬：

表6 紐莫康定C0凍干粉在CD3OD中的1H-NMR數據Tab.6 1H-NMR data in CD3OD of freeze-dried powder for pneumocandin C0

①1H譜顯示有43組氫，由低場到高場氫的積分比例分別為2:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:2:2:1:1:1:2:1:1:1:2:2:2:2:2:1:3:1:2:1:3:3:3，與紐莫康定C0凍干粉的結構相符。比較典型的有化學位移位于δ7左右的4個芳香氫信號，其中δ7.136處氫為一組雙重峰，質子數為2；gCOSY譜顯示，該氫與δ6.755氫相關，歸屬為15/19位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ129.690)相關，證實為15/19位氫。

②δ6.755處氫為一組雙重峰，質子數為2；gCOSY譜顯示，該氫與δ7.136氫相關，歸屬為16/18位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ116.219)相關，證實為16/18位氫。

③化學位移位于δ5至δ4左右的有8個連氧氫信號，其中δ5.297處氫為一組雙重峰，質子數為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.020氫相關，歸屬為9位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ75.747)相關，證實為9位氫。

④δ4.555處氫為一組多重峰，質子數為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.993氫相關，歸屬為3位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ68.247)相關，證實為3位氫。

⑤δ4.500處氫為一組多重峰，質子數為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ2.187，δ3.791氫相關，歸屬為33位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ71.359)相關，證實為33位氫。

⑥δ4.431處氫為一組單峰，質子數為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ2.058，δ3.491氫相關，歸屬為28位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ71.024)相關，證實為28位氫。

⑦δ4.370處氫為一組多重峰，質子數為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ5.082，δ2.853氫相關，歸屬為22位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ70.902)相關，證實為22位氫。

⑧δ4.273處氫為一組單峰，質子數為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.273，δ4.305氫相關，歸屬為12位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ76.989)相關，證實為12位氫。

⑨δ4.273處氫為一組單峰，質子數為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.273氫相關，歸屬為13位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ75.806)相關，證實為13位氫。

⑩δ4.020處氫為一組多重峰，質子數為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ5.297氫相關，歸屬為8位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ70.551)相關，證實為8位氫。

?化學位移位于δ1左右的有4個甲基氫信號，其中δ1.163處氫為一組雙重峰，質子數為3；gCOSY譜顯示，該氫與δ1.334氫相關，歸屬為49位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與甲基碳(δ20.214)相關，證實為49位氫。

?δ0.873處氫為一組雙重峰，質子數為3；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.555氫相關，歸屬為4位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與甲基碳(δ19.749)相關，證實為4位氫。

?δ0.860處氫為一組雙重峰，質子數為3；gCOSY譜顯示，該氫與δ1.070氫相關，歸屬為48位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與甲基碳(δ11.610)相關，證實為48位氫。

?δ0.849處氫為一組雙重峰，質子數為3；gCOSY譜顯示，該氫與δ1.483氫相關，歸屬為50位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與甲基碳(δ20.748)相關，證實為50位氫。

上述數據與紐莫康定C0的結構相符。

(2)13C核磁共振譜

本研究對紐莫康定C0凍干粉樣品的13C-NMR譜、DEPT譜、13C-1H相關譜(gHMQC)、遠程13C-1H相關譜(gHMBC)進行了測試。測定數據見表7，13C-NMR譜圖解析如下：

表7 紐莫康定C0凍干粉在CD3OD中的13C-NMR數據(ppm)Tab.7 13C-NMR data (ppm)in CD3OD of freeze-dried powder for pneumocandin C0(ppm)

①13C 譜顯示5 0 組碳峰。結合DEPT 譜、gHMQC譜及gHMBC譜，可得出碳的類型包括：3×CH3CH，1×CH3CH2，15×CH2，3×CH，1 4×C H X，4×C H=，1×C=，1×X C=和8×XC=O，這與紐莫康定C0凍干粉的結構相符。比較典型的有化學位移位于δ170左右的8個氨基酸羧基碳信號，其中δ177.426處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ2.853，δ2.548H23遠程相關，歸屬為24位的季碳。

②δ175.671處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ2.241H36遠程相關，歸屬為35位的季碳。

③δ174.596處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.993H2，δ4.610氫31遠程相關，歸屬為1位的季碳。

④δ174.527處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.993H2，δ4.520氫6遠程相關，歸屬為5位的季碳。

⑤δ173.360處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.610H31遠程相關，歸屬為30位的季碳。

⑥δ172.944處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.583H26遠程相關，歸屬為25位的季碳。

⑦δ172.536處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.305H11遠程相關，歸屬為10位的季碳。

⑧δ169.172處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ5.082H21，δ4.583H26遠程相關，歸屬為20位的季碳。

⑨化學位移于δ158至δ116處的6個碳峰是酪氨酸對位取代苯上的碳信號，其中δ158.493處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H15/19，δ6.755H16/18遠程相關，歸屬為17位的季碳。

⑩δ132.970處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ6.755H16/18遠程相關，歸屬為14位的季碳。

?δ129.690 處碳峰，在gHMQC 譜中與δ7.136H15相關，歸屬為15位的次甲基碳， gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H19遠程相關，歸屬為15位的次甲基碳。

?δ129.690 處碳峰，在gHMQC 譜中與δ7.136H19相關，歸屬為19位的次甲基碳，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H15遠程相關，歸屬為19位的次甲基碳。

?δ112.219 處碳峰，在gHMQC 譜中與δ6.755H16相關，歸屬為16位的甲基碳，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H18遠程相關，歸屬為16位的次甲基碳。

?δ112.219處碳峰，在gHMQC譜中與δ6.755氫18相關，歸屬為18位的甲基碳，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H16遠程相關，歸屬為18位的次甲基碳。

?此外，化學位移于δ76至δ68左右的8個碳峰均為羥基碳信號，化學位移于δ62至δ51左右的8個碳峰均為與氮相連的碳信號，化學位移于δ30至δ20左右的碳峰是脂肪酸鏈上末端甲基和亞甲基的碳信號。

上述數據與紐莫康定C0的結構相符。

2.4.4 紫外吸收光譜(UV)

測定條件：試劑見表8。

表8 紫外吸收光譜測定條件Tab.8 Determination conditions of UV absorption spectrum

紐莫康定C0凍干粉樣品的紫外吸收光譜測定數據見表9。解析如下。

表9 紐莫康定C0凍干粉的UV譜測定數據Tab.9 UV spectrum measurement data of freeze-dried powder for pneumocandin C0

(1)在水溶液中，λmax=218 nm 的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環K帶躍遷吸收峰。

(2)在0.1mol/L NaOH溶液中，λmax=216 nm 的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環K帶躍遷吸收峰，λmax=289 nm的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環B帶躍遷吸收峰。

(3)在甲醇溶液中，λmax=224 nm的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環K帶躍遷吸收峰，λmax=310 nm的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環B帶躍遷吸收峰。

以上紫外吸收光譜表明：本品中可能含有苯環等官能團。

2.4.5 綜合解析

對制備所得凍干粉綜合解析如下。

(1)紫外吸收光譜表明，本品含苯基等結構，與紐莫康定C0凍干粉結構相符。

(2)紅外光譜顯示，本樣品中存在甲基、羥基、氨基、羰基、苯環等結構，該樣品的紅外光譜圖特征與紐莫康定C0凍干粉結構相符。

(3)1H譜顯示有43組氫，由低場到高場氫的積分比例分別為2:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:2:2:1:1:1:2:1:1:1:2:2:2:2:2:1:3:1:2:1:3:3:3，與紐莫康定C0凍干粉的結構相符。

(4)本品的13C譜顯示50組碳峰，這與紐莫康定C0凍干粉的結構相符。

(5)質譜測得本品的加合離子峰[M+H]+，其質荷比為m/z1065.6，與紐莫康定C0凍干粉的加合離子峰(分子量為1064.5)一致。

綜上，將該樣品同時進行紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜、質譜分析，結果顯示樣品與紐莫康定C0結構相符。本研究制備所得的C0凍干粉即為紐莫康定C0。

3 討論

目前，國內外在紐莫康定分離純化的研究中，多集中于紐莫康定B0，對其同分異構體C0的制備鮮有報道。王欣榮等[13]給出了一種高效分離純化紐莫康定的方法，將紐莫康定A0和C0進行了有效分離和去除，但是并沒有提供能夠提純紐莫康定C0的具體措施。孟慧云等[14]在絲狀真菌SIIA-F1108產生抗真菌物質的分離純化和結構鑒定的研究中，能夠得到純度在95%以上的組分，并進行了相關結構鑒定，但是并未制備出色譜純度高于99.00%、且量在克級水平的樣品。本研究通過提取工藝富集、高壓液相色譜制備、濃縮、干燥，能夠制備出色譜純度99.19%，1.7395g紐莫康定C0。凍干粉經檢測，峰純度為999.4，熱重為3.05%，在C0含量上提供了有力保證，并且經過了紫外吸收光譜、紅外光譜、核磁共振、質譜等4大譜結構分析，確證了其結構，為質量研究及下游卡泊芬凈合成雜質傳遞研究提供了可靠的物質基礎，可以為紐莫康定其他雜質的制備提供思路。另外，本研究制備出的紐莫康定C0色譜純度高，峰純度合格，通過熱重法檢測水分含量少，可以作為該雜質的對照品使用。