補腎活血方對子宮內膜干細胞移植治療薄型子宮內膜大鼠子宮內膜CD34、整合素ανβ3、LIF表達的影響

尹曉丹，楊維，辛明蔚，武穎，何軍琴

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院中醫科，北京 100026)

薄型子宮內膜通常是指卵泡發育成熟(直徑≥18 mm)時或人絨毛膜促性腺激素注射日，子宮內膜厚度≤7 mm，其在自然妊娠及輔助生殖技術周期中較常見，與植入率和妊娠率較低相關。雖然臨床上也有子宮內膜在4 mm和5 mm時妊娠的報道，但子宮內膜厚度≤7 mm與妊娠率較低有關[1]。有研究表明，子宮內膜薄可導致1/2～2/3的妊娠失敗[2]。目前，臨床上治療薄型子宮內膜主要有口服、肌內注射或局部應用雌激素以及促性腺激素釋放激素類似物、他莫昔芬和生長激素等其他激素類治療，亦有應用低劑量阿司匹林、西地那非等改善子宮內膜血流等治療。從中醫學角度將薄型子宮內膜歸類于不孕癥的治療，認為腎虛、沖任二脈失養乃至不能攝精受孕；亦可由于胞宮損傷，氣滯血瘀乃至不能成孕。腎虛與血瘀之間相互影響，因此補腎填精、益氣養血活血是中醫藥對薄型子宮內膜的主要治法[3]。本研究主要探討補腎活血方對子宮內膜干細胞(endometrial stem cells，EDSCs)移植治療薄型子宮內膜大鼠子宮內膜CD34、整合素ανβ3及白細胞抑制因子(leukocyte inhibitor factor，LIF)表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物 選用20只無特定病原體級別8周齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(200±30) g；42只8～10周齡雌性SD大鼠，體重(220±30) g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物生產許可證號：SCXK(京) 2016-0004；動物使用許可證號：SYXK(京)2015-0004。動物適應環境3 d；室溫(22±1) ℃，濕度(40±10)%，光照周期12 h/12 h。本研究通過中研子創(北京)生物科技有限公司實驗動物倫理委員會批準(批準文號：20190801LL)。

1.1.2藥品及試劑 補腎活血方組成：淫羊藿10 g、肉蓯蓉10 g、鹿角15 g、羌活6 g、細辛3 g等。煎藥濃縮后，藥物濃度為4 g/ml，置于4 ℃冰箱貯存備用。以上藥物由北京同仁堂有限公司加工。戊酸雌二醇(德國拜耳公司生產，規格：1 mg/片)、羥基脲(齊魯制藥有限公司生產)、高分子右旋糖酐(瑞士Amwesham Biosciences公司生產，批號：Dextran70)，1%青霉素-鏈霉素(批號：15140122)、20%胎牛血清(批號：10099141)購自美國Gibco公司，CD34抗體(批號：bs-8996R)、整合素ανβ3抗體(批號：bs-1310R)、LIF抗體(批號：bs-1058R)購自北京博奧森生物技術有限公司，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號：PC0020)、十二烷基苯磺酸鈉(批號：S8010)購自北京索萊寶科技有限公司，辣根酶標記的山羊抗兔IgG[天德悅(北京)生物科技有限責任公司生產，批號:S004F]等。

1.1.3儀器 雙穩態數字電泳儀(上海雙奇生物科技有限公司生產，型號：DYY-6C)、全波長掃描多功能閱讀機(美國Termo公司生產，型號：6-1536)、生物組織擴增機(武漢中天設備有限公司生產，型號：KD-RS1)、自動組織包埋機(德國萊卡生物公司生產，型號：ZT-MS)、ChemiScope Mini 3300化學發光成像儀(上海勤翔科學儀器有限公司生產)等。

1.2方法

1.2.1EDSCs的分離及培養 將20只雌性大鼠頸椎脫臼法處死，取出子宮，浸入4%的多聚甲醛固定。將子宮組織切碎，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗，然后在膠原酶Ⅲ(300 mg/L)+DNA酶(40 mg/L)中消化，在37 ℃下攪拌30～45 min。將分散的細胞溶液通過一個70目的篩子，去除腺體上皮成分。將過濾后的細胞溶液離心(1 000×g，離心5 min)，傾出上清液并重新懸浮在最低限度的必需培養基中，加入酚紅、1%抗生素-抗霉菌劑和20%胎牛血清。然后，將重新懸浮的細胞置于塑料瓶中，在37 ℃的濕潤環境中維持。在37 ℃的加濕房間(5%的二氧化碳)中進行擴增，持續1周。用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液消化上述原代細胞，并以1∶2傳代。取第3代細胞，冷凍備用。

1.2.2腎虛血瘀薄型子宮內膜模型的建立 將42只SD大鼠依據隨機數字法分為正常對照組、模型組、戊酸雌二醇組、EDSCs+尾靜脈注射組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組，每組6只。每日早上9:00觀察陰道涂片，判斷靜止期后開始造模。除正常對照組外，其余組均造模。SD大鼠胃內灌服羥基脲450 mg/(kg·d)，連續10 d，從第4天開始皮下注射腎上腺素0.3 mg/(kg·d)，連續7 d。大鼠出現拱背、不愛活動、掉毛等，然后出現耳朵、爪子和尾巴發黑發紫，提示有血瘀，最終形成腎虛血瘀模型[4]；腎虛血瘀模型SD大鼠開腹找到子宮，向宮腔注入95%的無水乙醇。反復輕輕抽吸，沖洗子宮腔5 min，拔出針頭，另一側子宮按上述方法操作，關閉腹部。造模36只，均造模成功。

1.2.3干預方法 正常對照組：常規灌服0.9%氯化鈉溶液；模型組：建模后常規灌服0.9%氯化鈉溶液；戊酸雌二醇組：建模后按0.3 mg/(kg·d)劑量灌服戊酸雌二醇；EDSCs+尾靜脈注射組：建模后，經尾靜脈注射含107個EDSCs的PBS細胞懸液體1 ml；EDSCs+宮腔注射組：建模后，經宮腔注射含107個EDSCs的PBS細胞懸液體1 ml；EDSCs+尾靜脈注射+中藥組：建模后，經尾靜脈注射含107個EDSCs的PBS細胞懸液體1 ml，并灌服補腎活血方40.1 g/(kg·d)；EDSCs+宮腔注射+中藥組：建模后，經宮腔注射含107個EDSCs的PBS細胞懸液體1 ml，并灌服補腎活血方40.1 g/(kg·d)；補腎活血方劑量參照《藥理實驗方法學》[5]中劑量換算。連續灌胃3個動情周期。

1.3觀察指標

1.3.1免疫組織化學法檢測子宮內膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達 配制過氧化物酶阻斷緩沖液和抗原封閉液；在封閉液中稀釋1∶100的抗CD34、整合素ανβ3以及LIF抗體；石蠟切片常規脫蠟，將培養在蓋玻片上的組織用4%多聚甲醛在-20 ℃下固定5 min，然后用PBS洗凈。在4 ℃下將兔單克隆抗CD34、整合素ανβ3、LIF和兔單克隆抗phospho-CD34、ανβ3、LIF的一級抗體在蓋玻片上過夜。PBS清洗后，用生物素化的第二抗體處理蓋玻片，再次使用PBS清洗。使用氨基乙基咔唑作為底物處理組織，采用OlympusBX顯微鏡進行觀察。

1.3.2Western blot檢測子宮內膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達 將組織樣品中加入預冷的無線電免疫沉淀反應實驗裂解液，充分研磨后離心提取組織總蛋白。使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度進行定量。取等量蛋白樣品(30 μg/樣品)，加入變性非還原性蛋白上樣緩沖液，97 ℃加熱6 min變性，室溫冷卻離心后上樣。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，聚偏氟乙烯膜轉膜，封閉液(含吐溫20的Tris緩沖液/5%脫脂奶粉)封閉30 min。加入CD34、整合素ανβ3、LIF一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。含吐溫20的Tris緩沖液洗膜后，加入辣根酶標記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室溫孵育1 h后，含吐溫20的Tris緩沖液漂洗。加入ECL化學放光試劑顯影。ChemiScope Mini 3300化學發光成像儀拍照，Quantity One軟件分析蛋白表達量。

2 結 果

2.1EDSCs細胞形態觀察 觀察可見1 d后，少量貼壁細胞；3 d后，貼壁細胞明顯增多，多呈紡錘形；培養4～5 d后，貼壁細胞可見漩渦狀或放射狀生長；7～10 d后，可見細胞菌落融合成片，覆蓋在培養瓶底部，消化通過后細胞貼壁速度加快，見圖1。后續實驗選擇第3代細胞。

圖1 光學顯微鏡下子宮內膜干細胞形態(×100) 1a為第0代細胞培養第3天，1b為第3代細胞培養第3天

2.2免疫組織化學法檢測的各組大鼠子宮內膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達 模型組CD34、整合素ανβ3、LIF的表達低于正常對照組(P<0.01)；戊酸雌二醇組、EDSCs+尾靜脈注射組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組的CD34、整合素ανβ3、LIF表達均高于模型組(P<0.05)；EDSCs+宮腔注射+中藥組的整合素ανβ3、LIF的表達高于EDSCs+宮腔注射組(P<0.05)，但兩組間CD34表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖2、3、4。

表1 各組SD大鼠子宮內膜CD34、整合素ανβ3、LIF表達的比較

圖2 各組免疫組織化學檢測CD34的表達(二氨基聯苯胺法染色，×100) 2a為正常對照組，2b為模型組，2c為戊酸雌二醇組，2d為子宮內膜干細胞(EDSCs)+尾靜脈注射組，2e為EDSCs+宮腔注射組，2f為EDSCs+尾靜脈注射+中藥組，2g為EDSCs+宮腔注射+中藥組

圖3 各組免疫組織化學檢測整合素ανβ3的表達(二氨基聯苯胺法染色，×100) 3a為正常對照組，3b為模型組，3c為戊酸雌二醇組，3d為子宮內膜干細胞(EDSCs)+尾靜脈注射組，3e為EDSCs+宮腔注射組，3f為EDSCs+尾靜脈注射+中藥組，3g為EDSCs+宮腔注射+中藥組

圖4 各組免疫組織化學檢測LIF的表達(二氨基聯苯胺法染色，×100) 4a為正常對照組，4b為模型組，4c為戊酸雌二醇組，4d為子宮內膜干細胞(EDSCs)+尾靜脈注射組，4e為EDSCs+宮腔注射組，4f為EDSCs+尾靜脈注射+中藥組，4g為EDSCs+宮腔注射+中藥組

2.3Western blot檢測的各組大鼠子宮內膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達 CD34表達：模型組低于正常對照組(P<0.01)；戊酸雌二醇組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+宮腔注射+中藥組高于模型組(P<0.01)，其他干預組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；EDSCs+宮腔注射組高于EDSCs+尾靜脈注射組(P<0.05)，EDSCs+尾靜脈注射+中藥組與EDSCs+尾靜脈注射組比較差異無統計學意義(P>0.05)；EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組高于EDSCs+宮腔注射組(P<0.05)。整合素ανβ3表達：模型組低于正常對照組(P<0.01)；戊酸雌二醇組、EDSCs+尾靜脈注射組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組高于模型組(P<0.01)；EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組高于EDSCs+尾靜脈注射組(P<0.05)；EDSCs+宮腔注射+中藥組高于EDSCs+宮腔注射組(P<0.05)，EDSCs+尾靜脈注射+中藥組與EDSCs+宮腔注射組比較差無統計學意義(P>0.05)。LIF表達：模型組低于正常對照組(P<0.01)；戊酸雌二醇、EDSCs+尾靜脈注射組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組均高于模型組(P<0.01)，其他干預組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖5。

表2 各組SD大鼠子宮內膜CD34、整合素ανβ3、LIF表達的比較

注：LIF為白細胞抑制因子，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，EDSCs為子宮內膜干細胞

3 討 論

從第一個證明子宮內膜內存在成體干細胞的發現至今已有10年[6]。在這項研究中，子宮內膜組織中的干細胞收集后可以在體外大量擴增，且可用于自體或異體干細胞的移植，而不存在風險。Alawadhi等[7]報道，將EDSCs進行宮腔移植可以治療宮腔粘連綜合征。Musina等[8]研究發現，經血中可分離并培養出子宮內膜間充質干細胞，具有取材容易、無創等優點。EDSCs在維持子宮內膜組織動態平衡、月經后內膜修復和重建中發揮重要作用[5]。EDSCs自我更新和再生可補充、替代因月經期脫落、組織損傷和細胞凋亡而喪失的細胞并重建新的子宮內膜腔，是維持正常月經周期功能的細胞生物學基礎[9]。

一項關于從7個歐洲生殖中心招募的782對夫婦的不孕研究發現，生育力隨年齡增長而下降[10]。其中不孕的原因有輸卵管、結核病等感染引起的盆腔炎癥、子宮方面的問題、輸卵管結扎、子宮內膜異位癥以及高齡等[11]。子宮內膜容受性差是不孕癥最常見的原因之一，影響胚胎植入。研究表明，中醫藥可以促進子宮的容受性[12]。本研究采用的補腎活血方是首都醫科大學附屬北京婦產醫院中醫科創始人趙松泉總結幾十年臨床經驗所創。全方具有補腎益精、活血化瘀、調經促孕的功效。補腎藥物配伍養血活血之品更能調暢氣血，從而調節性腺功能。研究發現，本方通過補腎、養血、活血以調理月經治療不孕癥[3]。

CD34是一種跨膜磷脂蛋白，最早在造血干細胞和祖細胞中被發現[13]。在臨床上，CD34與骨髓移植造血干細胞的選擇和富集有關[14]。CD34不僅在間充質干細胞中表達，還在許多其他非造血細胞中表達[15]，包括間充質細胞和血管內皮細胞[16]。整合素ανβ3是最重要的細胞表面受體家族[17]。整合素ανβ3通過促進局部血管參與內膜的蛻膜過程而促進胚胎植入[18-19]。LIF蛋白在多種組織中表現出不同的生物學活性[20]。因此，本研究通過檢測上述指標來評估子宮內膜容受性。本實驗通過免疫組織化學及Western blot法對血管內皮細胞標志蛋白CD34進行檢測，結果顯示各干預組CD34表達均不同程度的增加，其原因可能是在建立腎虛血瘀薄型子宮內膜大鼠模型后，產生了無菌性的子宮內膜損傷，在采用尾靜脈、宮腔注射EDSCs及灌服補腎活血方治療后可以促進子宮內膜細胞的增生[21]。本研究進一步應用免疫組織化學和Western blot法檢測子宮內膜容受性指標整合素ανβ3、LIF，結果顯示各干預組大鼠子宮內膜整合素ανβ3、LIF的表達均增加，加用中藥后效果更佳，提示移植EDSCs不僅可以促進子宮內膜細胞增生，還可以改善子宮內膜容受性。有研究發現，以小鼠EDSCs移植治療能夠修復損傷的子宮內膜[22]。亦有研究采用自體EDSCs移植治療重度宮腔粘連，可以重建和修復子宮內膜[23]。

綜上所述，補腎活血方可以增加EDSCs移植治療薄型子宮內膜大鼠子宮內膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達，從而起到改善子宮內膜容受性的作用。內皮細胞的增生與子宮內膜容受性標志蛋白的表達并非呈線性關系。這種情況一方面可能由于存在實驗誤差，另一方面也提示應進一步探討評價子宮內膜容受性的指標。