脂肪來源間充質干細胞的成軟骨分化及其在膝關節軟骨損傷修復中的研究進展

李新通，毛世剛，范寶珠，劉洋，潘瑋敏，黃曉宇，劉凱

(1.青島市市立醫院康復醫學科，山東 青島 266071； 2.大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000；3.西安體育學院運動與健康科學學院，西安 710068)

關節軟骨是高度分化的結締組織，可使關節具有較好的彈性以及幾乎無摩擦的運動[1]。膝關節的軟骨損傷較常見，60%～66%接受膝關節鏡檢查的患者會出現軟骨損傷[2]。由于軟骨無直接的血液、淋巴供應或神經支配，再生潛力有限，若不及時治療可能發生進行性軟骨變性，最終引起骨關節炎[3]。目前，臨床常用的軟骨損傷修復方法主要包括微骨折技術、軟骨下骨鉆孔和自體軟骨細胞植入等，但可獲得性有限且具有供體部位并發癥，限制了其進一步臨床應用[4]。近年來，隨著組織工程技術的發展，間充質干細胞在修復軟骨損傷方面已取得一定進展，且具有獲得和培養相對容易、免疫原性弱、成軟骨分化能力等特點，同時其安全性也得到證實[5]。脂肪來源間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)具有軟骨分化潛能，且來源豐富、獲取容易、同源性好、生長快速；此外，與骨髓間充質干細胞相比，ADSCs供體部位不良反應少，因此具有巨大的臨床應用潛力[6]。近年來，研究者以ADSCs的成軟骨分化機制為基礎，從生長環境、培養條件等方面探索高效的ADSCs成軟骨分化過程，并逐步應用于臨床膝關節軟骨損傷的治療。現就ADSCs的成軟骨分化及其在膝關節軟骨損傷修復中的研究進展予以綜述。

1 ADSCs的生物學特性

干細胞具有貼壁生長、表達特異性細胞表面抗原、自我更新和多向分化潛能等特征。Zuk等[7]于2001年首次發現人體脂肪細胞提取物具有干細胞特性，并將其命名為ADSCs。ADSCs來源廣泛、取材方便，目前絕大多數ADSCs是通過脂肪抽吸術或脂肪切除術并經膠原酶消化、離心分離獲得。研究表明，ADCSs接種24 h后，細胞貼壁呈大小不一的圓形、多角形或短梭形狀；進入增殖期ADSCs 逐漸伸展，形態呈現出與成纖維細胞相似的長梭形[8]。國際脂肪應用技術協會指出，新分離的ADSCs 表型為CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，經過體外培養的ADSCs表型則為CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+[9]。由于ADSCs無明確的特異性表面抗原，未來應進一步關注體外ADSCs的高效分離和純化。

ADSCs具有包括成軟骨分化在內的多項分化潛能。體外和體內實驗均顯示，與骨髓間充質干細胞相比，ADSCs的軟骨分化能力較低，但ADSCs增殖更快，能夠較好地維持增殖分化潛能、抗氧化防御系統以及能量代謝等，使其不受所處疾病微環境的影響，從而更好地耐受缺血、缺氧等關節軟骨微環境引起的凋亡，發揮抗炎作用，使ADSCs在病理環境中仍可調節微環境[4，10]。此外，ADSCs還具有不易凋亡、來源廣泛、容易獲得等優勢[6]，且ADSCs的人類白細胞抗原-ABC表達相對較少，因此免疫排斥發生率更低，更適用于同種異體移植[11]。

但ADSCs的生物學特性受供者年齡、脂肪采集部位等影響，且隨著年齡的增長，在端粒縮短、DNA損傷累積以及氧化應激等因素作用下，ADSCs的增殖能力逐漸降低[12]。Tang等[13]研究發現，來源于內臟的ADSCs具有更好的增殖效果，來源于皮下的ADSCs則在免疫抑制性以及成軟骨潛能等方面具有優勢。另有研究表明，取材于髕下脂肪墊的ADSCs表現出更強的抗炎和抗衰老能力，與皮下脂肪組織來源的ADSCs相比具有更佳的軟骨缺損修復潛能[14-16]。因此，未來的研究應充分考慮ADSCs生物學特性的多重影響，從而更好地促進ADSCs在軟骨損傷修復方面發揮高效的作用。

2 ADSCs成軟骨分化過程及調控途徑

2.1ADSCs成軟骨分化過程 ADSCs的骨系分化與成脂分化相互聯系，成脂分化誘導增強可抑制骨系基因，促進成脂基因表達；骨系分化誘導增強，與成脂分化相關的轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體保留于胞質中，成脂基因表達受到抑制，而與ADSCs分化為骨-軟骨祖細胞相關的Runt相關轉錄因子2則從胞質轉移至胞核，導致骨系基因表達增強，分化為骨-軟骨祖細胞[17-18]。骨-軟骨祖細胞具備成骨分化和成軟骨分化能力，而成軟骨分化受SRY相關高遷移率族盒蛋白9(SRY-related high mobility group-box 9，Sox-9)與Runt相關轉錄因子2平衡的調控，其中Sox-9保留軟骨形態表型，而Runt相關轉錄因子2充當成骨分化的主要轉錄調節因子；經誘導向軟骨細胞方向分化的骨-軟骨祖細胞可穩定表達Sox-9，并促進Ⅱ型膠原、Ⅸ型膠原、蛋白聚糖以及軟骨低聚基質蛋白等軟骨基質蛋白的表達[16，19]。

2.2ADSCs成軟骨分化調控途徑 由于ADSCs具有多向分化潛能，將其應用于膝關節軟骨損傷修復時應充分考慮使其向目標細胞類型的高效轉化。目前的研究表明，可通過外源性生長因子及特定培養基、低氧環境、新型生物材料支架等調節ADSCs向軟骨細胞分化[20]。

ADSCs分化為軟骨細胞的傾向高度依賴于培養條件，將其置于特定的生長因子中更有利于ADSCs的成軟骨分化。據報道，ADSCs的成軟骨分化潛能減弱可能是由于缺乏轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1受體或骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信使RNA表達降低所致[21]。TGF-β超家族是目前主要的軟骨誘導生長因子。有研究發現，ADSCs可通過TGF-β1途徑促進糖胺多糖、Sox-9、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α等表達，抑制破壞軟骨再生的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-3和MMP-13的表達，同時調節具有抑制軟骨細胞凋亡作用的胱天蛋白酶3的表達[22]，表明ADSCs對促進軟骨細胞增殖及再生均具有積極作用。另有研究利用TGF-β3和BMP-6誘導ADSCs，結果發現，2～4周內軟骨細胞形成并被Ⅱ型膠原蛋白包圍，同時10個主要的軟骨形成基因表達均上調，經組織學、免疫組織化學和基因表達譜證實，ADSCs在培養物中被轉化為透明樣軟骨[23]。此外，TGF-β2、BMP-2、BMP-7、BMP-9以及BMP-14等也可使脂肪干細胞發生軟骨分化，但大多需3～4周才能完全分化[19，24]。已有研究證實，一些生長因子(如成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子1)可通過下調腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑基因的表達、激活磷酸化促分裂原活化的蛋白激酶等途徑上調Sox-9的表達，發揮促進軟骨形成的作用[11，18]。

由不同生長因子參與組成的培養基也被應用于體外誘導ADSCs成軟骨分化。常見的方案包括：①杜爾貝科改良伊格爾培養基和TGF-β3、白蛋白(1.25 μg/ml)、地塞米松(1×107mol/L)、抗壞血酸(6.25 μg/ml)、轉鐵蛋白和胰島素(6.25 μg/ml)[25]；②杜爾貝科改良伊格爾培養基+1%胎牛血清，TGF-β1(10 ng/ml)、抗壞血酸-2-磷酸酯(50 nmol/L)、胰島素(6.25 μg/ml)[7]；③OriCell成軟骨誘導分化培養基和TGF-β3、地塞米松、抗壞血酸、ITS細胞培養添加劑、丙酮酸鈉以及脯氨酸[26]。雖然不同生長因子參與組成的培養基對體外誘導ADSCs成軟骨分化的影響目前仍不明確，但良好的生物因子及化學因子環境最終可促進ADSCs成軟骨分化。

此外，通過改變物理因子環境(如創造缺氧條件、離心重力刺激)，ADSCs也可選擇性成軟骨分化。低氧環境可使缺氧誘導因子穩定表達，從而促進ADSCs增殖及成軟骨分化相關基因表達，以提高其軟骨分化效率[27]。但不同濃度的氧對ADSCs成軟骨能力的影響存在差異。培養環境限制在5%的氧氣條件或可更好地提高ADSCs的軟骨選擇性和生成量，而1%～3%的低氧條件對ADSCs成軟骨能力無影響[28]。此外，利用離心重力刺激和支架也可促進軟骨發生。由離心力對細胞培養物施加壓力等形成的機械力，可通過對細胞外應激的反應影響ADSCs的成軟骨分化，且有利于降低污染風險、節約操作時間[29]。據報道，2 400×g條件下，15 min離心重力刺激可顯著提高Sox-9基因和蛋白的表達水平[30]。

雖然在適當的誘導環境下ADSCs可分化為軟骨，但軟骨細胞在二維表面的生長容易達到接觸抑制，長期培養會產生去分化，導致Ⅰ型膠原蛋白表達增加、Ⅱ型膠原蛋白表達減少[31]。而常見的三維培養方法主要包括微球培養、微團培養以及支架法，但微球培養和微團培養存在營養不足等缺陷，因此目前的研究更多地關注支架材料。大部分三維模型構造的關鍵在于模擬軟骨細胞所處的天然軟骨細胞外基質，借助于模型的理化性質和生物學特性形成接近生理狀態的軟骨結構[18]。合格的三維支架材料不但具備親水性、細胞黏性、孔隙率、良好的力學性能以及可控的降解速率等優勢，還可通過模仿生理環境或利用趨化劑誘導移行克服體外細胞間接觸帶來的生長抑制作用，增加細胞間交流[32]；同時，輕度缺氧狀態還可通過激活磷酸化p38促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶B及缺氧誘導因子-1α信號通路上調Sox-9表達，具有良好的促軟骨分化能力[33]。近年來，隨著組織工程技術的發展，生物可降解乳酸-乙醇酸支架、非網眼聚乙醇支架、Ⅱ型膠原透明質酸支架、聚乙二醇聚丙炔共聚物蛋白支架、京尼平交聯生物支架、3D膠原海綿支架、軟骨脫細胞支架等不斷出現，對促進ADSCs的軟骨分化及性能的維持具有重要意義[34-35]。但目前的支架材料仍存在強度不足、軟骨分化不全以及去分化等方面的缺陷，相信隨著支架材料的不斷改進，可制備出更具有臨床應用價值、理想的軟骨組織工程支架材料。

總之，ADSCs的成軟骨分化是一個復雜的過程，高度依賴于生長環境及培養條件。雖然存在通用方法，但具體哪種條件組合可優化ADSCs的產量、提高軟骨分化能力目前尚未達成共識，仍需未來進一步研究闡明。

3 ADSCs在膝關節軟骨損傷修復中的應用

3.1動物研究 ADSCs憑借較好的成軟骨分化能力成為治療軟骨損傷的潛在方法。目前的研究主要集中于由大鼠及兔等動物構建的膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)模型或軟骨缺損模型的ADSCs治療。Mei等[36]在KOA模型大鼠關節內注射懸浮于60 μl磷酸鹽緩沖液中的單劑量ADSCs(1.0×106個細胞)觀察其療效，并從宏觀和組織學角度評估發現，ADSCs的有益作用在治療后4周出現，ADSCs治療后大鼠的軟骨退化顯著減輕，但并未誘導生成新軟骨，治療后8周，與僅應用60 μl磷酸鹽緩沖液的大鼠相比，應用ADSCs治療的KOA大鼠關節軟骨退變明顯較弱。表明ADSCs可有效抑制軟骨退變，后續研究也支持這一觀點[37-38]。Zhou等[37]將ADSCs(2.0×106個細胞)注射入KOA模型大鼠的膝關節腔(每周2次，共8次)，結果發現ADSCs可通過誘導自噬減少促炎細胞因子分泌、抑制軟骨細胞凋亡，并在調節成纖維細胞生長因子受體1、盤狀結構域受體2、磷酸化鈣-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ/鈣-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ以及磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B等信號轉導方面發揮重要作用，減輕大鼠KOA癥狀。另有研究證實，與單獨ADSCs或軟骨細胞治療相比，ADSCs(1.0×107個細胞)和軟骨細胞共培養并單次注射3個月后，關節軟骨再生能力顯著增強[39]。表明ADSCs與其他物質共培養可能是提高ADSCs成軟骨分化能力、修復軟骨缺損的有效途徑。此外，ADSCs在兔模型中也廣泛應用。Dragoo等[40]分離新西蘭白兔的自體ADSCs并在體外誘導后種植于纖維蛋白膠支架上培養1周，最后再移植至其軟骨損傷區，8周后評估顯示，新西蘭白兔表面軟骨損傷區被透明樣軟骨填充，軟骨下骨全部被修復。研究表明，Ⅴ型膠原蛋白可通過增強ADSCs的增殖分化能力顯著上調軟骨相關基因Ⅱ型膠原a1和聚蛋白多糖的表達，下調Pou5fl(POU domain,class 5,transcription factor 1)的表達，誘導兔KOA模型軟骨退行性變區域Ⅱ型膠原蛋白水平顯著增加，并表現出軟骨厚度和軟骨細胞數量增加、蛋白聚糖丟失及凋亡軟骨細胞數量減少等典型的關節軟骨再生跡象[41]。膠原蛋白對軟骨的黏附和形成至關重要，而Ⅴ型膠原蛋白是保持軟骨骨架結構完整性的關鍵成分，未來應進一步揭示Ⅴ型膠原蛋白在ADSCs軟骨修復過程中的潛在作用。此外，部分學者通過構建比格犬KOA模型、巴馬小型豬軟骨缺損模型等研究發現，ADSCs也可發揮促進細胞外基質合成、軟骨細胞增殖以及抗炎等作用，并表現出積極的膝關節軟骨修復作用[42-43]。但不同的ADSCs注射劑量和治療方案均可在一定程度上影響療效或研究結果，因此在進一步臨床應用前還應在動物模型基礎上嚴謹評估ADSCs的安全性及長期有效性。

3.2臨床研究 雖然目前關于ADSCs的研究逐漸增多，且ADSCs作為修復膝關節軟骨損傷的方法在動物模型中已顯現出積極效果，但涉及人類受試者的研究仍較少。Spasovski等[44]應用濃度為(0.5～1.0)×107的ADSCs單次注射治療KOA患者，軟骨組織修復磁共振觀察評分結果顯示，患者膝關節軟骨修復明顯，且疼痛、膝關節功能等均顯著改善。Koh等[45]通過關節鏡檢查發現，ADSCs(4.04×106個細胞)具有軟骨再生促進作用。Jo等[46]通過隨機雙盲臨床研究證明，使用自體ADSCs治療膝關節軟骨缺損具有積極作用，治療后軟骨缺損區域的軟骨厚度增加，且有光滑的新生軟骨生成；此外，ADSCs注射劑量與關節軟骨再生量相關，1.0×108的ADSCs注射劑量可以更好地改善膝關節疼痛與功能障礙。但有研究指出，患者臨床癥狀改善可能與ADSCs分泌的具有抗炎、免疫等功能的細胞因子或旁分泌有關，經ADSCs注射治療后受試者的膝關節磁共振成像并未發生明顯改變[47]。這一研究結果得到了Pers等[48]的支持。由于目前的研究有限且不同的研究中ADSCs來源、治療方式以及評價方法不同，難以對各研究的結果進行比較，研究結果以及最終結論存在爭議，未來仍需大樣本研究和長期隨訪以探究確切的軟骨修復證據。

關于ADSCs治療的安全性，Lee等[49]研究表明，關節內注射ADSCs治療KOA可有效抑制軟骨損傷的發展，改善患者膝關節功能，且隨訪6個月未發生不良事件。但也有研究報道，脂肪采集手術后患者會出現輕微的不適和瘀傷，且經ADSCs治療后部分患者仍存在疼痛、腫脹，且癥狀可持續3 d至4周[50]。此外，干細胞治療在臨床實踐中還可能出現畸胎瘤、免疫排斥反應以及批次、劑量依賴性作用的非穩定性等問題，均需謹慎對待[51]。雖然目前人體試驗研究中ADSCs軟骨修復作用及安全性尚存在爭議，但不可否認ADSCs療法為膝關節軟骨損傷患者提供了一種便捷的非侵入性治療方案。目前尚不清楚ADSCs在人體內是直接通過修復軟骨組織起作用還是通過信號分子促進軟骨修復，因此ADSCs在膝關節軟骨損傷修復中的作用機制、療效及長期安全性仍需進一步研究。

4 小 結

組織工程化軟骨與宿主的完美結合是軟骨修復的終極目標。雖然ADSCs具有多向分化潛能，但通過TGF-β超家族等外源性生長因子、特定培養基、物理因子環境等也可促進ADSCs向軟骨細胞高效分化。此外，ADSCs還具有取材方便、產量較高、免疫原性較低等生物特性，為膝關節軟骨損傷修復提供了一種極有前景的治療方法。但由于目前相關臨床報道較少，其安全性和有效性還需更多高質量的研究驗證。未來的研究應基于ADSCs的多重優勢并以明確ADSCs成軟骨分化機制為基礎，深入探究體外ADSCs與生長因子及三維誘導環境之間的關系以及誘導成軟骨分化完全的措施，進一步促進ADSCs在膝關節軟骨損傷修復中的應用。