下調lncRNA-H19表達促進人瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡和自噬

黃 云，許喜生，陳 凱，何 秀

(1.郴州市第一人民醫院 燒傷整形外科，湖南 郴州 423000； 2.郴州市第一人民醫院兒童醫院 兒童呼吸內科，湖南 郴州 423000)

瘢痕疙瘩(keloid)俗稱疤痕疙瘩，屬于皮膚良性腫瘤的一種，也是困擾皮膚及傷口正常愈合的主要問題之一[1]。Keloid發病機制復雜且不明確，目前研究發現，成纖維細胞異常增殖及胞外基質異常沉積是keloid形成的主要病理表現[2]，抑制成纖維細胞過度增殖并促進其凋亡，對緩解keloid形成發展有一定的臨床意義[3]。自噬在細胞凋亡、存活過程中發揮重要的調控作用[4]，其過度自噬及自噬不足，均可影響細胞的功能穩態而參與細胞凋亡及存活過程[5]。但自噬在keloid成纖維細胞(keloid fibroblasts，KFs)異常增殖中扮演怎樣的角色，也一直存在爭議[6]。長度大于200的非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可廣泛參與細胞增殖、分化、衰老、凋亡、周期調控及X染色體印跡等多種生物學過程[7]，而受到臨床研究的重視。已有研究發現lncRNA-H19在keloid組織表達中異常增高，且下調lncRNA-H19能抑制KFs增殖[8]，但lncRNA-H19下調是否能通過調控自噬，促進KFs凋亡，來緩解keloid病理進程，還不甚清楚。本研究體外培養KFs細胞，對此進行探討，以期闡明lncRNA-H19在KFs自噬、凋亡中的靶向調控機制，為keloid的治療提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞及主要試劑：人類瘢痕成纖維細胞系(KFs)(上海細胞研究所)；健康人皮膚成纖維細胞系(human dermal fibroblasts,HDFs)(上海朗生科技有限公司)；DMEM培養基[舜冉(上海)生物科技有限公司]；反轉錄試劑盒(上海研卉生物科技有限公司)；Ad-mTOR和ad-eGFP(規格200μL，腺病毒滴度為2×109PFU/mL,感染效率大于85%)(南京善本生物科技有限公司)；lncRNA-H19F低表達腺病毒(si-lncRNA-H19)及不含si-lncRNA-H19的空病毒載體(si-eGFP)[漢恒生物科技(上海)有限公司]；Caspase3及PARP、自噬標記蛋白-LC3Ⅱ、Atg7、mTOR及磷酸化mTOR(p-mTOR)和ULKl抗體(均Abcam公司)；吖啶橙(Ao)熒光染色試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組處理：取KFs及HDFs細胞系常規復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在恒溫培養箱中常規貼壁傳代培養。

取對數期KFs及HDFs細胞，按6×104個/孔接種于6孔板內，并設置為HDFs組、KFs組、si-lncRNA-H19+KFs組、si-eGFP+KFs組，每組設置6個復孔。HDFs組及KFs組不做任何處理正常培養，si-lncRNA-H19+KFs組及si-eGFP+KFs組待KFs細胞匯合度達50%～60%時，采用腺病毒向KFs細胞感染lncRNA-H19低表達序列及空載體，記為si-lncRNA-H19+KFs組及si-eGFP+KFs組。各感染組于感染后24 h，取細胞進行后續試驗，用qRT-PCR法檢測各組細胞感染效果。

取KFs細胞，按1×105個/孔接種于96 孔板內，并設置為：KFs組(未感染組)、si-lncRNA-H19+Ad-mTOR組、si-eGFP+Ad-mTOR組、si-lncRNA-H19+Ad-eGFP組、si-eGFP+Ad-eGFP組，si-lncRNA-H19+Ad-mTOR組感染lncRNA-H19低表達腺病毒(si-lncRNA-H19)及mTOR過表達腺病毒(Ad-mTOR)；si-eGFP+Ad-mTOR組感染lncRNA-H19空載體腺病毒(si-eGFP)及Ad-mTOR，si-lncRNA-H19+Ad-eGFP組感染si-lncRNA-H19及mTOR空載體(Ad-eGFP)；si-eGFP+Ad-eGFP組感染si-eGFP及Ad-eGFP，各組均于感染后24 h，取細胞按1.2.6方法檢測細胞凋亡與自噬相關蛋白表達。

1.2.2 qRT-PCR檢測不同細胞系中lncRNA-H19相對表達水平：取對數期KFs及HDFs細胞，用RNA試劑盒提取總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒進行PCR反應(反應體系：上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL，2×SYBR mix 10 μL，10×cDNA模板1 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火55 s，50個循環，72 ℃延伸15 min)。lncRNA-H19(上游引物：5′-TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG-3′，下游引物：5′-CGGAAGTAAGGTGGCTAGACC-3′)以GAPDH為內參，用2-ΔΔCt算法，計算lncRNA-H19表達水平。

1.2.3 流式細胞測量術檢測細胞凋亡率：細胞用胰蛋白酶消化6 min，1 000 r/min離心5 min，1 mL磷酸緩沖溶液重懸后合并沉淀物制成單細胞懸液，按annexinV-EGFP/PI雙染試劑盒說明書方法進行，染色孵育后，在流式儀上進行上機檢測。

1.2.4 透射電鏡及吖啶橙(Ao)熒光染色觀察細胞自噬：取細胞，沿培養皿壁加入戊二醛固定、包埋并制成切片后，置于透射電鏡下觀察細胞自噬小體及自噬溶酶體形成情況。

取細胞，制成單細胞懸液，用4%多聚甲醛固定10 min后，加入終濃度為5 μg/mL的Ao試劑，避光孵育10 min后，置于熒光顯微鏡下觀察自噬泡形成情況。

1.2.5 免疫組化法檢測細胞mTOR陽性表達：取細胞，制成單細胞懸液，用4%多聚甲醛固定10 min后，加入一抗抗體(mTOR，1∶500)4 ℃孵育6 h，加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶1 000)室溫孵育30 min后，用DAB顯色，蘇木精復染后，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 Western blot檢測細胞蛋白表達：取細胞，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法測定細胞蛋白濃度后，取50 μg蛋白樣品行上樣、電泳、轉膜反應，加入一抗caspase3、PARP、mTOR、p-mTOR、ULKl抗體(1∶1 500)，內參抗體GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶二抗(1∶3 000)，室溫下孵育4 h。顯影曝光后，用化學發光成像分析系統拍照并分析灰度值。每組試驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同細胞系中lncRNA-H19表達變化

瘢痕成纖維細胞系(KFs)中lncRNA-H19表達為(2.06±0.13)，顯著高于正常皮膚成纖維細胞系(HDFs)的(1.09±0.08)(P<0.05)。

2.2 下調lncRNA-H19表達后對KFs細胞lncRNA-H19表達的影響

與HDFs組比較，KFs組細胞lncRNA-H19表達升高(P<0.05)；與KFs組相比，si-lncRNA-H19+KFs組細胞lncRNA-H19表達降低(P<0.05)(表1)。

表1 細胞lncRNA-H19表達比較

2.3 下調lncRNA-H19表達后對KFs細胞凋亡的影響

與KFs組細胞相比，si-lncRNA-H19+KFs組細胞凋亡率升高(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 各組細胞流式凋亡圖Fig 1 Flow cytometric diagram of cell apoptosis in each group

表2 各組細胞凋亡率比較

2.4 下調lncRNA-H19表達后對細胞自噬的影響

HDFs組細胞粗面內質網及高爾基體豐富、線粒體結構正常，偶見個別線粒體腫脹及自噬小體和自噬溶酶體出現；KFs組及si-eGFP+KFs組可見多個粗面內質網腫脹、擴張，內含大量膠原蛋白，線粒體大量腫脹，胞質內有大量細胞器殘體；si-lncRNA-H19+KFs組可見大量雙層膜囊泡樣結構的自噬小體包繞胞質或細胞器，大量單層膜結構的自噬溶酶體內含部分尚未分解的內質網、線粒體等細胞器殘體(圖2)。

→indicate autophagosome and auto lysosome圖2 細胞電鏡觀察圖Fig 2 Electron microscope observation of cells (×80 00)

2.5 下調lncRNA-H19表達后對細胞自噬泡形成數目的影響

與HDFs組比較，KFs組細胞自噬泡形成數目降低(P<0.05)，mTOR陽性表達升高(P<0.05)；與KFs組細胞相比，si-lncRNA-H19+KFs組細胞自噬泡形成數目升高(P<0.05)，mTOR陽性表達降低(P<0.05)(圖3，表3)。

2.6 下調lncRNA-H19表達后對細胞凋亡及自噬相關蛋白表達的影響

與HDFs組比較，KFs組細胞caspase3、PARP、LC3Ⅱ、Atg7、ULKl蛋白表達降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達升高(P<0.05)；與KFs組細胞相比，si-lncRNA-H19+KFs組細胞caspase3、PARP、LC3Ⅱ、Atg7、ULKl蛋白表達升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達降低(P<0.05)(圖4，5)。

→indicate autophastc vesicles圖3 各組細胞Ao染色圖Fig 3 Ao staining image of cells in each group (×400)

表3 各組細胞自噬泡形成數目比較

2.7 si-lncRNA與Ad-mTOR共感染后對細胞凋亡及自噬相關蛋白表達的影響

與KFs組比較，si-eGFP+Ad-mTOR組細胞caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表達降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達升高(P<0.05)；si-lncRNA-H19+Ad-eGFP組細胞caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表達升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達降低(P<0.05)。與si-lncRNA-H19+Ad-eGFP組相比，si-lncRNA-H19+Ad-mTOR組caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表達降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達升高(P<0.05)(圖6，7)。

A.HDFs；B.KFs；C.si-lncRNA-H19+KFs;D.si-eGFP+KFs圖4 各組細胞凋亡及自噬相關蛋白表達免疫印跡圖Fig 4 Immunoblotting diagram of apoptosis and autophagy-related protein expression in each group

*P<0.05 compared with HDFs group；#P<0.05 compared with KFs group圖5 各組細胞中凋亡及自噬相關蛋白表達水平比較Fig 5 Comparison of the expression levels of apoptosis and autophagy-related proteins in each group of cells

A.KFs；B.si-lncRNA-H19+Ad-eGFP；C.si-lncRNA-H19+Ad-mTOR；D.si-eGFP+Ad-mTOR；E.si-eGFP+Ad-eGFP圖6 各組細胞凋亡及自噬相關蛋白表達免疫印跡圖Fig 6 Immunoblotting diagram of apoptosis and autophagy-related protein expression in each group

3 討論

Keloid好發于10～30歲的健康人群，約有86%keloid患者產生難以控制的瘙癢癥狀，并在很大程度上給患者造成心理自卑及社交障礙[9]。Keloid發生機制不明，臨床上仍無特殊有效的方法延緩并根治keloid。KFs異常增生和胞外基質過度沉積被認為是keloid形成的主要病理表現，尋找抑制KFs增生、促進KFs凋亡的有效方法，是臨床研究keloid的重點方向。lncRNA-H19能通過調控原癌基因表達、編碼生長因子及相關受體表達， 來參與細胞增殖及分化過程[10]。lncRNA-H19在keloid組織中表達異常升高，敲低lncRNA-H19后，可降低lncRNA-H19對相關RNA調控作用，達到抑制KFs增殖、促進KFs凋亡的目的，并認為lncRNA-H19可能是keloid治療的潛在靶點[11]。本研究發現敲低lncRNA-H19后，KFs凋亡異常升高，證實下調lncRNA-H19表達可促進KFs凋亡，影響KFs存活。

自噬與腫瘤細胞凋亡關系密切。腫瘤早期，自噬激活可通過自噬性死亡的方式發揮抑制腫瘤增殖作用，而在后期，自噬激活卻能通過分解、吸收、回收利用代謝物質的方式，滿足腫瘤對能量和營養的需求，促進腫瘤細胞存活[12]。但自噬在keloid過程中扮演怎樣的角色，也一直存在爭議。在自噬調控過程中，Atg7可與LC3結合形成泛素鏈參與自噬泡的形成，且LC3Ⅱ或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的變化可判斷自噬處于自噬激活還是抑制狀態[13]。另外，mTOR通路也是自噬調控的核心通路之一，大量研究發現，mTOR中的mTORC1磷酸化激活后，可影響自噬基因ULKl復合體形成，抑制自噬泡的生成，且mTOR通路活化與keloid形成機制有關[14]。本研究發現，KFs細胞中mTOR活性升高的同時，KFs細胞自噬處于抑制狀態，提示mTOR通路活化介導的自噬抑制，可能與KFs凋亡降低關系密切。lncRNA-H19可激活mTOR途徑，誘導細胞自噬激活[15]。本研究發現，敲低lncRNA-H19后，KFs細胞mTOR活性降低，細胞自噬及凋亡活性顯著升高。但敲低lncRNA-H19的同時， 促進mTOR活性， lncRNA-H19低表達發揮的抑制mTOR活化、促進KFs細胞自噬及凋亡作用被明顯減弱。

*P<0.05 campared with KFs； #P<0.05 campared with si-lncRNA-H19+Ad-eGFP圖7 各組細胞中凋亡及自噬相關蛋白表達比較Fig 7 Comparison of apoptosis and autophagy-related protein expression in cells of each group

綜上所述，下調lncRNA-H19表達，可抑制mTOR途徑活化，促進KFs細胞自噬及凋亡。這為闡明keloid病理發生發展機制提供一定理論依據，但細胞凋亡與自噬關系復雜，涉及多個RNA及靶蛋白的調控，lncRNA-H19與mTOR及自噬等的靶向調控作用，還有待進一步探究。