膿毒癥早期BMP-2和BMP-4的變化

溫 燕，林金燦，黃穎泓，肖文彪，張民偉，林建東*

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 福建 福州 350005； 2.廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，福建 廈門(mén) 361003)

膿毒癥(sepsis)定義為，由感染引起的機(jī)體反應(yīng)失調(diào)所致的危及生命的器官功能障礙[1]。在膿毒癥的病理過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)是病原體及其毒素的主要靶點(diǎn)。已證實(shí)內(nèi)皮功能障礙早期參與了膿毒癥的發(fā)生發(fā)展[2]。因此，早期評(píng)估膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可為膿毒癥診斷和治療提供有價(jià)值的信息。

研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族的不同亞型與血管生物學(xué)有關(guān)。BMP信號(hào)主要由BMP-2/4/6/9/10觸發(fā)，其中BMP-2和BMP-4存在于人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells，MECs)中，調(diào)節(jié)EC的遷移和毛細(xì)血管的形成[3-4]，BMP-2和BMP-4表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)內(nèi)皮促炎表型，增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮的間黏附[5-7]。這表明，BMP-2/4信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可影響內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為，BMP-2/4信號(hào)通路可能成為內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)的潛在靶點(diǎn)。

然而，目前關(guān)于BMP-2/4信號(hào)通路的研究多集中于大血管內(nèi)皮細(xì)胞，BMP-2/4在膿毒癥微血管內(nèi)皮功能障礙中的作用尚未明確。因此，本研究旨在探討B(tài)MP-2和BMP-4在膿毒癥早期的變化及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試者：根據(jù)2016年膿毒癥國(guó)際指南診斷膿毒癥[1]。入選自2017年5月1日至2020年5月1日入住廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)和福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 ICU 的膿毒癥患者(膿毒癥組)和非膿毒癥患者(非膿毒癥組)。招募18歲以上的健康志愿者作為對(duì)照組。膿毒癥組的入選標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡>18周歲；2)確診膿毒癥；3)膿毒癥的上游疾病為細(xì)菌性肺部感染或腹腔感染。非膿毒癥組的入選標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡>18周歲；2)輕型肺部細(xì)菌感染患者或因腹部器官非感染性疾病入住ICU的患者；3)ICU住院期間無(wú)新發(fā)感染。膿毒癥組和非膿毒癥組的排除標(biāo)準(zhǔn)為：1)自身免疫性疾病；2)腫瘤活動(dòng)期；3)骨修復(fù)期；4)肺血管疾病如肺動(dòng)脈高壓、肺栓塞等。健康對(duì)照組的排除標(biāo)準(zhǔn)為:1)入組前1個(gè)月內(nèi)患有細(xì)菌或病毒感染；2)入組前1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)抗生素治療。該研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[閩醫(yī)大附一倫理醫(yī)研(2021204)]。所有受試者或其法定監(jiān)護(hù)人需簽署知情同意書(shū)。該研究符合1975年赫爾辛基宣言的倫理準(zhǔn)則。

收集所有受試者的一般信息，及膿毒癥組和非膿毒癥組的感染性指標(biāo)。

1.1.2 試劑及試劑盒：BMP-2、BMP-4和內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司)，總 RNA 純化試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)結(jié)合的山羊抗兔 IgG 抗體和 DAB 顯色液(上海生工生物技術(shù)有限公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒和TaqMan探針(TaKaRa公司)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma-Aldrich公司)；抗BMP-2抗體、抗磷酸化 Smad1/5(phosphorylated Smad1/5，pSmad1/5)抗體和抗BMP受體Ⅱ(BMP receptor Ⅱ，BMPRⅡ)抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.3 細(xì)胞：原代大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells，RPMECs)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 采集血樣：收集膿毒癥組(24例)和非膿毒癥組(25例)患者入住 ICU 24 h 內(nèi)及健康志愿者(對(duì)照組，24例)的空腹外周靜脈血標(biāo)本，離心獲得血清，將血清樣品等分后，-20 ℃ 保存。

1.2.2 ELISA定量檢測(cè)BMP2、BMP-4和 ET-1：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定血清 BMP-2、BMP-4和 ET-1濃度。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度(A)值。

1.2.3 RPMECs 的培養(yǎng)和處理:于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)原代 RPMECs。第2～3代的 RPMECs 用于實(shí)驗(yàn)。用梯度濃度的 LPS(0、10、100和1 000 ng/mL)孵育 RPMECs[8]，3 h 后收集 RPMECs，提取總蛋白和總 RNA。

1.2.4 免疫印跡法檢測(cè)BMP-2、pSmad1/5和 BMPRⅡ：用1.2.3中的 RPMECs 總蛋白，按文獻(xiàn)報(bào)道[8]的方法進(jìn)行免疫印跡分析；用Image J軟件分析蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè) BMP-2 mRNA和 BMPRⅡ mRNA：用1.2.3中的 RPMECs總 RNA，按PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用 LightCycler480系統(tǒng)和 Taqman 探針進(jìn)行 qPCR。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 受試者一般特征

最終入選24例膿毒癥患者(膿毒癥組，n=24)、25例非膿毒癥患者(非膿毒癥組，n=25)及24例健康志愿者(對(duì)照組，n=24)。與非膿毒癥組相比，膿毒癥組患者入ICU后24 h 內(nèi)的感染性標(biāo)志物水平顯著較高，包括血小板(platelet，PLT)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和白介素(interleukin，IL)-6(P<0.05)；膿毒癥組死亡率顯著較高，有更多的患者合并有多器官功能衰竭綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、需要機(jī)械通氣，且機(jī)械通氣時(shí)間顯著較長(zhǎng)(P<0.05)。

2.2 膿毒癥患者中血 BMP-2和 BMP-4的濃度顯著升高

膿毒癥組早期血清 BMP-2 和 BMP-4 水平顯著較高于對(duì)照組(P<0.05)，且膿毒癥組 BMP-2水平顯著高于非膿毒癥組(P<0.01)(圖1)。

There were significant differences on BMP-4(F=3.79，P=0.03) and BMP-2(F=6.36，P=0.003) between the three groups; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with non-sepsis圖1 膿毒癥組、非膿毒癥組和對(duì)照組間BMP-2、BMP-4和ET-1的比較Fig 1 Comparisons of BMP-2, BMP-4 and ET-1 between sepsis group, non-sepsis group and control group

2.3 BMP與膿毒癥相關(guān)的生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，膿毒癥組患者入住 ICU 24 h 內(nèi)的 BMP-2 水平與 PCT(r=0.45，P<0.01)、乳酸(r=0.66，P<0.01)、以及 IL-6(r=0.59，P<0.01)呈顯著正相關(guān)，且其BMP-4 與 ET-1(r=0.57，P<0.01)和 CRP(r=0.54，P<0.05)間亦呈顯著正相關(guān)；而非膿毒癥組僅 BMP-4 與 CRP(r=0.66，P<0.01)呈顯著正相關(guān)。

2.4 BMP-2具有良好的膿毒癥診斷性能

ROC 曲線分析 BMP-2 對(duì)膿毒癥與健康志愿者診斷價(jià)值，結(jié)果顯示出良好診斷性能(AUC=0.94，cutoff 值：50.40 pg/mL，靈敏度：87.50%，特異性：95.83%)；且BMP-2在區(qū)分膿毒癥患者與ICU非膿毒癥患者時(shí)(AUC=0.85，cutoff 值: 54.66 pg/mL，靈敏度:87.50%，特異性: 76.00%)也顯示出良好診斷性能。本研究中所有ROC 曲線分析均未顯示BMP-4對(duì)膿毒癥的良好診斷性能。

2.5 LPS 對(duì)RPMECs的SMAD信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

2.5.1 LPS處理的RPMECs的BMP-2表達(dá)的變化：LPS可誘導(dǎo) RPMECs的BMP-2表達(dá)增加，且該效應(yīng)具有LPS濃度依賴(lài)性(圖2A,B)。當(dāng) LPS 濃度≥100 ng/mL 時(shí)，經(jīng) LPS 處理的 RPMECs 的 BMP-2 表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05，圖2A,B)。

2.5.2 LPS對(duì)RPMECs 的 BMP/Smad1/5/8信號(hào)通路的影響：LPS 可顯著降低 RPMECs 的pSmad1/5和 BMPRⅡ 表達(dá)，且降低程度均與LPS濃度呈劑量依賴(lài)關(guān)系(P<0.05)(圖3A～C)，另外BMPRⅡ mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖3D)。

A.expression of BMP-2 detected by Western blot; B.relative expressions of BMP-2 of RPMECs grouped by concentrations of LPS; *P<0.05 compared with control group

A-C.expressions of pSmad1/5 and BMPRⅡ in LPS-treated PMECs were lower than them in untreated PMECs; D.RT-qPCR showed mRNA expressions of BMPRⅡ in LPS-treated PMECs lower than them in untreated PMECs; *P<0.05 compared with group control; #P<0.05 compared with non-sepsis group

3 討論

非感染性炎性研究表明，BMP-2/4在血管炎性反應(yīng)中表達(dá)顯著上調(diào)，是血管壁中的促炎和促動(dòng)脈粥樣硬化因子[5-6,9-10]。這提示BMP可參與人體炎性反應(yīng)。盡管研究表明，經(jīng)LPS處理的小鼠肺部BMP-2表達(dá)顯著升高[7]，但極少有研究報(bào)道BMP在臨床感染性疾病中變化。本研究經(jīng)臨床觀察首次證實(shí)膿毒癥早期BMP-2/4水平顯著升高，且BMP-2對(duì)感染性炎性反應(yīng)更加敏感，并對(duì)膿毒癥有良好的診斷功能，可能在早期膿毒癥的診斷中起重要作用。

內(nèi)皮細(xì)胞炎性是膿毒癥的關(guān)鍵病理生理特征，主要表現(xiàn)為肺微血管完整性受損和內(nèi)皮功能障礙[1,2]。通過(guò)細(xì)胞模型，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS處理的RPMECs的BMP-2的表達(dá)明顯更高，這進(jìn)一步證實(shí)了上述臨床發(fā)現(xiàn)。既往研究表明，BMP-2可促進(jìn)白細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞，這將誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和核因子-κB的表達(dá)升高，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)[7]。由BMP-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性因子又可下調(diào)BMP受體表達(dá)，進(jìn)而經(jīng)Smad1/5/8通路抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞中的ICAM表達(dá)和白細(xì)胞黏附[11-13]。本研究顯示經(jīng)LPS處理的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的磷酸化Smad1/5和BMPRⅡ表達(dá)顯著受抑制。這表明在膿毒癥早期，BMP-2在發(fā)揮促炎作用的同時(shí)，伴有Smad1/5/8信號(hào)通路抑制，這進(jìn)一步加劇了促炎反應(yīng)過(guò)程。

綜上所述，本研究證實(shí)膿毒癥早期BMP-2表達(dá)顯著升高，LPS可抑制Smad1/5/8信號(hào)通路，兩者共同驅(qū)動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)。這表明BMP-2可能是潛在的膿毒癥早期診斷標(biāo)志物且在膿毒癥早期起促炎作用。