氯胺酮減輕大鼠脊髓缺血/再灌注損傷

陳 勇，龐紅利，許遠征，毛珊珊，洪道先

(河南大學第一附屬醫院 麻醉與圍術期醫學科， 河南 開封 475001)

脊髓缺血/再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)具有二次損傷的特點，及時實施神經保護干預是改善SCII預后的關鍵[1]。氯胺酮(ketamine) 是一種非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，已被證實可通過調控相關通路、減輕炎性反應在小鼠腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用[2]，但其對SCII的作用及其機制如何目前尚不清楚。胞外調控蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)1/2信號通路已被證實參與包括SCII在內的多種器官的缺血/再灌注損傷過程[3-4]，因此，本研究擬探討不同劑量氯胺酮對SCII的作用及ERK1/2信號通路的影響，為SCII的預后改善措施提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF級雄性SD大鼠32只，體質量(300±15)g[河南省實驗動物中心，動物檢疫許可證號：SYXK(豫)2017-0001]。鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業有限公司)；兔抗ERK1/2單克隆抗體、兔抗大鼠p-ERK1/2單克隆抗體和山羊抗兔IgG(Invitrogen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物的分組處理：大鼠分為假手術組(S組)、SCII組、ketamine-L和ketamine-H組，每組8只。采用Zivin法[5]建立大鼠SCII模型：禁食不禁水8 h，腹腔注射1%戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，取仰臥位固定，沿腹正中偏左向下切開3 cm，暴露并分離腹主動脈，動脈夾夾閉45 min后松開。待檢查無出血，縫合傷口并涂抹紅霉素軟膏，并連續3 d腹腔注射硫酸慶大霉素液0.1 mg。S組大鼠行相同手術但不做夾閉處理。再灌注術后1 d，ketamine-L和ketamine-H組分別腹腔注射50和100 mg/(kg·d)氯胺酮，連續14 d；S和SCII組注射等體積0.9% NaCl溶液。本研究已經河南大學第一附屬醫院倫理委員會批準通過(批準號：2020-0603)。

1.2.2 神經行為學評分：采用改良Tarlov評分[6]評定大鼠后肢運動功能(表1)，術后6 h評分0～4分為造模成功。記錄各組大鼠再灌注后1、3、7和14 d的神經行為學評分結果。

1.2.3 Nissl染色觀察脊髓組織：14 d后斷頭處死

表1 改良Tarlov評分標準Table 1 Modified Tarlov criteria

大鼠，分離腰椎L3～L5節段脊髓，其中L4～L5節段置于-80 ℃冰箱中保存，L3～L4節石蠟包埋后切片。取組織石蠟切片常規脫蠟、水化后，用甲基紫染色液于56 ℃染色1 h，沖洗后用Nissl Differentiation(尼氏分化液)分化1～3 min，無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。顯微鏡下觀察神經元并計數。

1.2.4 TUNEL法檢測脊髓神經元凋亡率：取組織石蠟切片脫蠟復水，漂洗后滴加蛋白酶K修復液，37 ℃孵育30 min，3% H2O2去內源性雜質，清洗后滴加TUNEL反應液，37 ℃孵育2 h，滴加3% BSA室溫下封閉30 min；滴加DAB顯色，DAPI復染，封片后熒光鏡下觀察并采集圖像。計算脊髓前角細胞凋亡率：凋亡率(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5 ELISA法檢測脊髓組織炎性因子：取大鼠脊髓組織，勻漿，3 000 r/min離心15 min后取上清，按照ELISA試劑盒檢測白細胞介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-1，IL-6)及血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)水平。

1.2.6 脊髓組織氧化應激指標的檢測：取上述脊髓組織上清液檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、谷胱甘肽-過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)活性及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，嚴格按照相應試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測Erk1/2信號通路相關蛋白表達：取凍存脊髓組織加入200 μL RIPA緩沖液磨成勻漿，室溫孵育2 min，4 ℃ 14 000～16 000×g離心2 min，收集上清，提取脊髓組織總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。隨后進行電泳、轉膜、封閉后滴加一抗ERK1/2、p-ERK1/2，4 ℃孵育過夜后加二抗孵育1.5 h。ECL曝光成像，Image J定量分析蛋白相對表達量：目的條帶與內參β-actin的吸光度比值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠后肢運動學評分比較

與S組相比，再灌注1 d后SCII組大鼠后肢評分均顯著降低(P<0.05)，提示造模成功；與SCII組相比，再灌注3 d后ketamine-L和ketamine-H組評分均顯著升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group圖1 各組大鼠后肢運動功能改良Tarlov評分分析Fig 1 Modified Tarlov score analysis of hind limb motor function of rats in each group

2.2 Nissl染色分析

與S組相比，SCII組陽性神經細胞數目顯著減少(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-L和ketamine-H組陽性細胞數目均明顯增加(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group圖2 各組脊髓組織Nissl染色分析Fig 2 Nissl staining analysis of spinal cord tissue in each

2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡率

與S組相比，SCII組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-L和ketamine-H組細胞凋亡率均顯著下降(P<0.05)(圖3，表2)。

表2 各組細胞凋亡率比較分析

2.4 脊髓組織炎性因子水平變化

與S組相比，SCII組IL-1β、TNF-α、IL-6及VCAM-1水平均顯著升高(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-L和ketamine-H組各因子水平均顯著下降(P<0.05)(表3)。

2.5 氧化應激相關指標變化

與S組相比，SCII組SOD和GPX水平明顯降低，MDA、MPO水平顯著升高(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-L和ketamine-H組SOD和GPX水平明顯升高，MDA、MPO水平顯著降低(P<0.05)(表4)。

2.6 Erk1/2信號通路相關蛋白表達

與S組相比，SCII組p-ERK1/2及p-ERK1/2/ERK1/2值均明顯升高(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-H和ketamine-L組回降(P<0.05)(圖4)。

圖3 TUNEL法檢測各組大鼠脊髓組織細胞凋亡情況Fig 3 Apoptosis of spinal cord tissue cells in each group was detected by TUNEL method (×200)

表3 各組脊髓組織炎性因子水平變化Table 3 Changes of inflammatory cytokines in spinal cord tissue in each

表4 各組脊髓組織氧化應激相關指標變化Table 4 Changes of indexes related to oxidative stress in spinal cord tissue in each

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group圖4 ERK1/2信號通路相關蛋白的表達Fig 4 Expression of ERK1/2 signaling pathway related proteins

3 討論

研究表明SCII的發生涉及多種機制，病理過程可能與神經元變性、細胞凋亡和ERK1/2等信號通路的激活密切有關，且常伴有細胞內外離子紊亂、炎性反應、氧化應激及氧自由基增多等[7]。本研究中SCII大鼠Tarlov評分、陽性神經元數目及SOD和GPX水平顯著降低，凋亡率、炎性因子及MDA、MPO水平顯著升高，進一步驗證了現有研究結果。因此推測，抑制炎性反應、氧化應激反應、阻止神經細胞損害和凋亡，是改善SCII病情的關鍵。

氯胺酮是一種臨床廣泛應用的苯環已哌啶類靜脈麻醉劑。近年來，有研究表明[8]氯胺酮除麻醉作用外，還具有一定的抗感染和神經保護作用，可減輕多種器官的缺血再灌注損傷程度。如抑制心肌缺血再灌注細胞中Toll樣受體4(TLR4)和NF-κB的表達，減輕細胞損傷、發揮神經保護作用[9]；抑制NF-κB并激活Akt/mTOR信號通路，降低肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織細胞凋亡率、炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平及MDA含量和MPO活性，提高SOD活性[10]；提高腦缺血再灌注小鼠神經行為學評分，降低細胞凋亡率和炎性反應，影響NF-κB信號通路減輕損傷程度[11]。但目前關于氯胺酮與SCII作用關系的研究報道極少。為明確二者的作用關系，本研究檢測不同劑量氯胺酮處理的SCII大鼠的脊髓細胞凋亡、炎性及氧化應激反應，評估Tarlov，結果發現氯胺酮處理的SCII大鼠Tarlov評分均顯著升高，神經元陽性細胞數及SOD和GPX活性增高，細胞凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、VCAM-1水平及MDA含量、MPO活性顯著降低，提示氯胺酮可減輕SCII程度，且低劑量效果更優。此外，氯胺酮可通過抑制ERK1/2信號通路減輕神經炎性反應，改善抑郁大鼠的行為學表現[12]。但氯胺酮在SCII中對神經細胞的保護作用是否與ERK1/2信號通路有關目前尚無明確報道，而本研究中發現SCII大鼠p-ERK1/2、p-ERK1/p-ERK2和ERK1/ERK2明顯升高，氯胺酮處理后ERK1/2磷酸化水平回降，且低劑量回降幅度大于高劑量。

綜上所述，低劑量氯胺酮可減輕SCII程度，且ERK1/2信號通路可能參與該過程，但尚需后續更多的研究進一步證實。