醛糖還原酶抑制劑抑制屋塵螨誘導的人支氣管上皮細胞系BEAS-2氧化應激反應

鮑 敏，林 玫，甄海寧，何 芳，丁 敏，袁竹青，陳亞雋，薛欣欣

(武漢市第三醫院 呼吸與危重癥醫學科，湖北 武漢 430060)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種以可逆性的氣道痙攣、氣道高原反應等為特點的氣道慢性炎性反應疾病[1]。氣道上皮細胞是氣道的首要防線，可有效的抵御外界刺激，多種證據表明其在哮喘氣道炎性的啟動和維持中發揮關鍵作用[2]。有研究發現，阻斷或減弱醛糖還原酶(aldose reductase，AR)活性可緩解細胞功能損傷，目前醛糖還原酶抑制劑(aldose reductase inhibitors，ARIs)的研究已經取得一定成效[3]，中藥醛糖還原酶抑制劑分為多種，其中惱火黃酮類、生物堿類等，其因來源廣、副作用小的特點被廣泛應用，目前臨床用于治療糖尿病并發癥疾病，療效確切[4]，但ARIs對支氣管上皮細胞的作用機制研究較少。本研究探究醛糖還原酶抑制劑對屋塵螨誘導的人支氣管上皮細胞氧化應激反應的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人支氣管上皮細胞系BEAS-2B(ATCC公司)。

1.1.2 試劑：RPMI 1640培養基、胎牛血清(Invitrogen公司)；醛糖還原酶抑制劑(Pfizer公司)；地塞米松(Sigma Aldrich公司)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxidedis-mutase，SOD)檢測試劑盒(均購于中國碧云天生物技術研究所)；NF-κB抗體、p38 MAPK抗體(Cell Signal Technology公司)；屋塵螨(北京博蕾德生物科技有限公司)；NF-κB抑制劑PDTC(北京白奧萊博科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理：將BEAS-2B細胞分為對照組，模型組(屋塵螨50 μmol/L刺激)，NF-κB抑制劑(PDTC)組(PDTC干預模型組，10 μmol/L)，ARIs組(ARIs干預模型組，50 μmol/L)。

1.2.2 細胞中SOD活性和MDA含量的測定：將BEAS-2B細胞濃度調整為1×106個/L，檢測細胞中氧化應激指標MDA含量和SOD活性。

1.2.3 細胞中ROS含量的測定：將BEAS-2B細胞濃度調整為1×106個/L，加入終濃度10 μmol/L的活性氧熒光黃探針(DCFH-DA)，置于細胞于避光環境中，孵育30 min后，用PBS溶液洗滌，最后用流式細胞儀檢測熒光強度，來反應ROS含量。

1.2.4 ELISA檢測細胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量：用無菌離心管收集培養24 h后的細胞培養液，2 000 r/min離心20 min，收集上清液。ELISA檢測IL-5、IL-13、IFN-γ含量。

1.2.5 MTT法測定細胞存活率：取對數期的BEAS-2B細胞，按1×106個接種于96孔板中，100 μL/孔，將孔板置于培養箱中，培養細胞過夜，各組細胞的孔板內分別加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，用無血清的培養基避光孵育細胞4 h，棄掉上層血清，將二甲基亞砜溶液MTT再次加入到培養基中，對細胞在490 nm處的吸光度值進行測定，對細胞的存活率進行計算。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡：取對數期的各組BEAS-2B細胞，將細胞濃度調整為3×106個/L。用胰蛋白酶消化孔板內的細胞，離心細胞，5 min后棄掉細胞上清液，加入annexin V-FITC和PI于細胞中，避光孵育制成的細胞懸液，15 min后向每個流式管中加入400 μL上樣緩沖液，讓細胞充分混勻，上機檢測。

1.2.7 蛋白質印跡檢測細胞內NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表達：取對數期的各組BEAS-2B細胞加入胰蛋白酶消化細胞并離心，棄掉上清液后用PBS溶液重懸細胞，再次離心后裂解滑膜成纖維樣細胞，離心15 min后收集上清液并測定總蛋白含量。取30 μg蛋白上樣煮沸、電泳、PVDF膜轉印。封閉組織后加入一抗和二抗，充分混勻后孵育5 min，GABA一抗稀釋液加入到組織中，充分混勻后轉至PVDF膜上，顯色后測定蛋白的相對吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組細胞中SOD活性和MDA含量比較

模型組BEAS-2B細胞中SOD活性低于對照組，MDA含量高于對照組(P<0.05)；和模型組相比，PDTC組和ARIs組BEAS-2B細胞中SOD活性均升高，MDA含量均顯著降低(P<0.05)(表1)。

2.2 各組細胞中ROS含量比較

模型組BEAS-2B細胞中ROS含量較對照組明顯增加(P<0.05)；PDTC組和ARIs組BEAS-2B細胞中ROS含量較模型組明顯減少(P<0.05)(圖1)。

表1 各組SOD活性、MDA含量比較

2.3 各組細胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量比較

模型組BEAS-2B細胞中IL-5、IL-13含量顯著高于對照組細胞，IFN-γ含量較對照組顯著降低(P<0.05)；PDTC組和ARIs組BEAS-2B細胞中IL-5、IL-13含量明顯低于模型組，IFN-γ含量高于模型組(P<0.05)(表2)。

A.fluorescence detection of ROS content in each group; B.comparison of ROS content in each group *P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with model group

表2 各組細胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量比較

2.4 各組細胞存活率比較

模型組BEAS-2B細胞存活率低于對照組(P<0.05)；PDTC組和ARIs組BEAS-2B細胞存活率均明顯高于模型組(P<0.05)(圖2)。

2.5 各組細胞凋亡率比較

和對照組相比，模型組BEAS-2B細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；和模型組相比，PDTC組和ARIs組BEAS-2B細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 comparedwith model group圖2 各組細胞存活率比較Fig 2 Comparison of cell survival rate in each group

2.6 各組細胞中NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表達比較

和對照組相比，模型組BEAS-2B細胞中NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表達均顯著增加(P<0.05)；和模型組相比，PDTC組和ARIs組BEAS-2B細胞中NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表達均明顯降低(P<0.05)(圖4)。

3 討論

支氣管哮喘是一種異質性疾病[5]。研究發現，機體內產生的大量活性氧會導致氣道發生炎性反應，氣道高反應性和氣道重塑等[6-7]。研究證實，抑制哮喘大鼠中活性氧的生成，可減少嗜酸粒細胞的產生，抑制氣道免疫炎性反應[8]。可見支氣管哮喘存在氧化/抗氧化失衡現象，影響病理學改變。

SOD是抗氧化酶的一種，可清除細胞代謝過程中所產生的氧自由基，降低活性氧水平，保護支氣管。MDA是膜脂過氧化反應的產物之一，蓄積過多的氧化產物，導致蛋白質等大分子相互交聯，加重組織損傷[9]。本研究結果顯示，ARIs組細胞中SOD活性可降低MDA和ROS含量，提示醛糖還原酶抑制劑可改善屋塵螨誘導的支氣管上皮細胞中的氧化應激反應。近年來研究顯示，醛糖還原酶介導支氣管哮喘炎性反應的病理過程，可通過抑制炎性細胞因子和活性氧等抑制醛糖還原酶的活性，進而降低氣道發生的炎性反應和高反應性，對哮喘病理過程的進展有很好的療效[0]。

有研究發現，支氣管哮喘的發生通常被認為是輔助性T細胞介導的病原體所致炎性細胞浸潤而誘發[11]。其中Th1/Th2協調的不平衡是導致氣道高反應性發生的關鍵原因。IFN-γ為Th1的特征因子，IL-5、IL-13為Th2分泌的炎性因子[12]。本研究結果顯示，ARIs組細胞中IL-5、IL-13含量減少，IFN-γ含量增加，提示醛糖還原酶抑制劑可抑制屋塵螨刺激的支氣管上皮細胞中的炎性因子。醛糖還原酶(AR)可介導糖尿病慢性并發癥的發生，AR抑制劑(ARIs)可影響高糖誘導的視網膜病變，并且ARIs在臨床上長期使用的副作用也較小。動物實驗發現[13]AR介導哮喘炎性的發生發展，ARIs可抑制氣道上皮細胞內炎性因子的產生和聚集，同時抑制氧化應激反應以及氣道上皮細胞轉變為黏液分泌細胞，進而減少哮喘發生時的炎性反應，因此ARIs成為防治哮喘的新方向。

支氣管哮喘的肺部炎性機制與復雜的網絡傳導有著不可分割的聯系，其中NF-κB相關通路與p38 MAPK是導致支氣管哮喘整個發病過程的重要傳導機制，與哮喘等免疫和炎性反應有明顯相關性[14]。在正常情況下，NF-κB 穩定存在于細胞質中，當細胞激活后，p38 MAPK發生磷酸化降解，導致NF-κB核定位序列的暴露，進而進入細胞核內與目的基因特異性結合位點結合，促進包括IL-5和IL-13等目的基因的轉錄，提示了NF-κB和MAPK是治療支氣管哮喘的潛在靶點。本研究結果顯示，ARIs組細胞中NF-κB、NF-κB p65與p38 MAPK蛋白表達減少。研究證實，給予哮喘大鼠姜黃素干預，結果顯示干預組大鼠支氣管中多種炎性細胞數、IL-4、IL-5含量降低，浸潤的炎性細胞計數減少，其作用機制與調控NF-κB p65核轉位及磷酸化MAPK蛋白水平有關[15]。

A.cell apoptosis was detected by flow cytometry; B.comparison of apoptosis rates in each group；*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group

A.expression of NF-κB, NF-κB P65 and p38 MAPK protein in each group; B.comparison of NF-κB protein expression in each group (n=6); C.comparison of NF-κB p65 protein expression in all groups (n=6); D.comparison of p38 MAPK protein expression in each group (n=6)；*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with model group

綜上所述，醛糖還原酶抑制劑可抑制屋塵螨誘導的人氣道上皮細胞發生的氧化應激反應，促進BEAS-2B細胞增殖，抑制凋亡。