蟲草素抑制哮喘大鼠支氣管上皮細胞間充質轉化

湯麗萍，閆 瑾，范 芳，王 浩，黃 娜*

(1.空軍軍醫大學西京醫院 兒科， 陜西 西安 710032； 2.西安醫學院 醫學技術學院， 陜西 西安 710021)

哮喘(asthma)是最常見的慢性呼吸道疾病，以氣道炎性反應、重塑、阻塞和高反應性為特征[1]。氣道重塑是哮喘的關鍵病理特征，與哮喘癥狀的持續和不良臨床結局有關[2]。在氣道重塑過程中，氣道上皮屏障受損、上皮細胞黏附減少、上皮標志物減少以及間質標志物增多[2]，這些病理改變提示氣道上皮細胞可能通過上皮細胞間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)參與氣道重塑過程。EMT是上皮損傷后上皮細胞向間充質表型轉化的高度可塑性過程。TGF-β1的釋放和自分泌、氧化應激增強等因素均可誘導支氣管上皮細胞發生EMT[3]。EMT的發展通常伴隨著上皮標志物(例如E-cadherin)的丟失以及間充質標志物(例如N-cadherin、α-SMA和vimentin)的表達[4]。蛹蟲草(Cordyceps militaris)是一種傳統藥用菌。蟲草素(cordycepin，Cor)是從蛹蟲草中分離得到的主要生物活性成分，具有抗缺氧、抗感染、免疫調節和抗肝纖維化等多種藥理活性[5]。有研究顯示，蟲草素對慢性哮喘大鼠氣道重塑有明顯的抑制作用[6]。然而，目前還不清楚蟲草素是否通過影響哮喘的EMT過程來改善氣道重塑。為了驗證這一推論，本研究使用了一種哮喘大鼠模型和人支氣管上皮細胞來研究蟲草素在哮喘中的作用以及這一過程中可能涉及的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料:卵白蛋白(ovalbumin，OVA)、蟲草素、0.9%氯化鈉溶液(Sigma Aldrich公司)；Wright-Giemsa、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；E-cadherin一抗、c-Jun一抗、N-cadherin一抗、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMΑ)一抗、vimentin一抗、生物素標記的二抗、Alexa Fluor 555偶聯二抗、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗(Cell Signal Technology公司)；轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(R&D公司)；聚偏氟乙烯膜(Millipore公司)；Smad3、p-Smad3、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH一抗(Abcam公司)；增強型化學發光試劑(Santa Cruz Biotechnology公司)；細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(株式會社日本同仁化學研究所)；Transwell小室(Corning公司)；人支氣管上皮樣細胞系16HBE(ATCC細胞庫)。

1.1.2 動物:40只SPF級4～6周齡雄性SD大鼠{空軍軍醫大學第三附屬醫院[SYXK(陜)2020-004]}，體質量為60～80 g。實驗前，大鼠在標準實驗室條件下(25 ℃、55%相對濕度、12 h光暗循環照明)適應性飼養1周，不限制食物和水。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理:將大鼠隨機分為4組(n=10)：對照組、模型組(哮喘模型大鼠，OVA組)、OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組(分別用10和50 mg/kg的蟲草素治療的哮喘大鼠)。分別于第0、7、14天對OVA組、OVA+50 mg/kg Cor組和OVA+200 Cor組大鼠腹腔注射1 mL含有100 mg OVA和100 mg氫氧化鋁的0.9%氯化鈉溶液進行致敏，第21天起用50 μL 1% OVA(溶于0.9%氯化鈉溶液)滴鼻激發，連續7 d。另外，在第21天起，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組大鼠在激發前2 h灌胃10 mg/kg和50 mg/kg的蟲草素(溶于0.9%氯化鈉溶液)。對照組用0.9%氯化鈉溶液致敏、激發和灌胃，OVA組用0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.2 收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和計數細胞:最后一次激發24 h后，處死大鼠，用100 mL PBS沖洗肺，左氣管插管收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，向肺內注入3 mL PBS，抽吸3次。將細胞懸液4 ℃ 1 000 r/min離心10 min，然后重懸于1 mL 0.9%氯化鈉溶液中。對BALF中的白細胞進行Wright-Giemsa染色并計數。

1.2.3 組織學染色檢測大鼠肺氣道炎性反應和氣道重塑:用10%多聚甲醛固定大鼠左肺，石蠟包埋，切成3 μm厚的切片。HE染色評價氣道炎性反應和氣道重塑程度。Masson三色染色檢測上皮膠原沉積。檢測方法嚴格按照試劑盒說明進行。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測大鼠肺組織E-cadherin和α-SMA的表達水平:將大鼠肺組織切片烤片、脫蠟和水化后，用3% H2O2消除內源性過氧化物酶，微波爐中進行10 min抗原修復。然后在37 ℃用山羊血清封閉30 min。將切片與E-cadherin和α-SMA一抗在4 ℃過夜孵育(1∶500稀釋)，PBS清洗后，切片與生物素標記的二抗37 ℃孵育30 min，再與過氧化物酶試劑37 ℃孵育30 min，DAB顯色劑孵育37 ℃孵育5 min。蘇木精復染核5 min，自來水沖洗反藍，1%鹽酸乙醇分化5 s。常規脫水、透明封片后，用ImageJ軟件半定量測定E-cadherin和α-SMA的蛋白表達。

1.2.5 人支氣管上皮樣細胞系16HBE的培養和處理:將人支氣管上皮樣細胞16HBE培養在含8%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，培養條件為37 ℃、5% CO2。TGF-β1用于誘導EMT發生。用5 ng/mL的TGF-β1和不同濃度的蟲草素(10、20、40、80、160、320 μmol/L)處理16HBE細胞48 h。此外，將16HBE細胞分為3組，對照組(未處理的細胞)、TGF-β1組(5 ng/mL的TGF-β1處理的細胞)和TGF-β1+Cor組(5 ng/mL的TGF-β1和40 μmol/L蟲草素處理的細胞)用于后續實驗。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達水平:從大鼠肺組織和16HBE細胞中提取總蛋白并定量，樣品經8%、10%或12% SDS-PAGE分離并電轉移到聚偏氟乙烯膜。在用5%脫脂牛奶封閉2 h后，將膜與E-cadherin(1∶3 000稀釋)、N-cadherin(1∶1 000稀釋)、α-SMA(1∶3 000稀釋)、vimentin(1∶1 000稀釋)、Smad3(1∶2 000稀釋)、p-Smad3(1∶2 000稀釋)、ERK1/2(1∶1 000稀釋)、p-ERK1/2(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶3 000稀釋)的一抗4℃過夜孵育。然后與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶500稀釋)室溫孵育2 h。使用增強型化學發光試劑顯影，GAPDH作為內參蛋白。

1.2.7 CCK-8法檢測細胞增殖:將16HBE細胞按照2 000個細胞/孔(100 μL)加入96孔板中，用TGF-β1和蟲草素培養細胞48 h。然后去除培養基，加入10 μL的細胞計數試劑盒-8 (CCK-8)和100 μL無血清培養基，37 ℃、5% CO2孵育1～4 h。用BioTek微板分光光度計檢測450 nm處的吸光度值。

1.2.8 Transwell小室法檢測細胞遷移:將Transwell上室中加入2×105個細胞和200 μL無血清培養液，下室加入800 μL含10%胎牛血清的完整培養液。37 ℃孵育24 h后，洗滌細胞并用4%多聚甲醛固定，下室細胞用結晶紫染色。在奧林巴斯熒光顯微鏡下計數遷移至下室的細胞。

1.2.9 免疫熒光染色檢測16HBE細胞中c-Jun的表達:常規制作細胞玻片，用4%多聚甲醛固定20 min，室溫下用0.1% Triton X-100滲透20 min。用牛血清白蛋白清洗和封閉后，將玻片與c-Jun一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃孵育過夜。然后將載玻片與Alexa Fluor 555偶聯二抗在室溫下孵育2 h。滴加DAPI復染核5 min，用含熒光猝滅劑的封片液封片，置于顯微鏡下觀察，用ImageJ軟件計算圖像平均熒光強度。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 蟲草素對哮喘大鼠炎性反應和重塑的影響

與對照組相比，OVA組大鼠BALF的總細胞計數、嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞顯著增加(P<0.05)。與OVA組相比，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的上述細胞計數均減少(P<0.05)(表1)。對照組大鼠具有正常的肺組織形態，OVA組出現大量的炎性細胞浸潤，而OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的炎性細胞浸潤減少(圖1A)。對照組大鼠支氣管周圍無明顯膠原沉積，OVA組可見大面積的支氣管周膠原沉積，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組大鼠膠原沉積較OVA組減少(圖1A)。與OVA組相比，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的膠原纖維面積均減少，且呈劑量依賴性方式減少(P<0.05)(圖1B)。

2.2 蟲草素對哮喘大鼠氣道EMT的影響

與對照組相比， OVA組大鼠肺組織中E-cadherin的染色程度降低， 而α-SMA的染色程度增加(P<0.05)；與OVA組相比，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的E-cadherin的染色程度升高，而α-SMA的染色程度降低(P<0.05)(圖2)。與對照組相比，OVA組大鼠肺組織中E-cadherin蛋白表達水平降低，而N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達水平升高(P<0.05)。與OVA組相比，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的E-cadherin蛋白表達水平升高，而N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達水平降低，且均呈劑量依賴性方式變化(P<0.05)(圖3)。

表1 大鼠BALF中的細胞計數Table 1 Count of cells in rat BALF n=3)

A.HE staining and Masson’s trichrome staining image; B.percentage of collagen fiber area in Masson’s trichrome staining; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with OVA group; △P<0.05 compared with OVA+10 mg/kg Cor group

2.3 蟲草素對TGF-β1誘導的人支氣管上皮樣細胞增殖和遷移的影響

與0 μmol/L相比，當蟲草素濃度達到80 μmol/L后，人支氣管上皮樣細胞16HBE細胞活力顯著降低(P<0.05)(圖4A)。因此，在后續實驗中將蟲草素濃度設為40 μmol/L。與對照組相比，TGF-β1組的細胞活力和遷移細胞數均升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Cor組的細胞活力和遷移細胞數均降低(P<0.05)(圖4B～D)。

A.E-cadherin and α-SMA immunohistochemical staining image; B.average A value of E-cadherin and α-SMA; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with OVA group; △P<0.05 compared with OVA+10 mg/kg Cor group

A.Western blot; B.relative protein expression; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with OVA group; △P<0.05 compared with OVA+10 mg/kg Cor group

A.16HBE cell viability after treatment with different concentrations of cordycepin (CCK-8 method), *P<0.05 compared with 0 μmol/L; B.cell viability of 16HBE treated with 40 μmol/L cordycepin and TGF-β1 (CCK-8 method); C.migrating cells in the Transwell experiment; D.number of migrating cells; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group

2.4 蟲草素對TGF-β1誘導的人支氣管上皮樣細胞EMT的影響

與對照組相比，TGF-β1組16HBE細胞中E-cadherin蛋白表達水平降低，而N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達水平升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Cor組的E-cadherin蛋白表達水平升高，而N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達水平降低(P<0.05)(圖5)。

2.5 蟲草素對TGF-β1誘導的人支氣管上皮樣細胞中Smad3、ERK1/2和c-Jun表達的影響

與對照組相比，TGF-β1組16HBE細胞中p-Smad3和p-ERK1/2蛋白表達水平升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Cor組的p-Smad3和p-ERK1/2蛋白表達水平降低(P<0.05)。各組的Smad3和ERK1/2蛋白表達水平均無顯著變化(P>0.05)(圖6)。與對照組相比，TGF-β1組16HBE細胞中c-Jun的相對熒光強度升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Cor組的c-Jun的相對熒光強度降低(P<0.05)(圖7)。

3 討論

據報道，蟲草素可降低OVA致敏哮喘小鼠氣道壁厚度、抑制促炎細胞因子、減少BALF中的嗜酸粒細胞和中性粒細胞數[6]。在哮喘小鼠中，蟲草素通過抑制p38-MAPK和NF-κB信號通路來抑制Th2型反應，從而發揮平喘特性[7]。本研究結果也證實了蟲草素對哮喘大鼠炎性反應和氣道重塑的抑制作用。另外，本研究中，蟲草素以劑量依賴性方式升高哮喘大鼠肺組織中上皮標志物E-cadherin蛋白表達水平，而降低間充質標志物N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達水平，這些結果表明蟲草素抑制了哮喘大鼠EMT過程及氣道重塑。

A.Western blot; B.relative protein expression; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group

A.Western blot; B.relative protein expression; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group

A.immunofluorescence staining image; B.relative fluorescence intensity of c-Jun; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group

上皮細胞是哮喘發生過程中最具活性的分泌組織細胞之一，在哮喘氣道重塑過程中，上皮細胞通過分泌多種生長因子或轉化為肌成纖維細胞，從而加速EMT。EMT過程中，上皮細胞失去極性及細胞間的黏附作用，并通過細胞骨架的重組從而獲得遷移能力，進一步加速氣道重塑。TGF-β1是細胞存活和分化的重要調節因子，它可以促進上皮細胞和間質細胞纖維連接蛋白和膠原的產生[8]。目前，越來越多的證據表明TGF-β1是EMT的誘發因子[9]。因此，本研究使用TGF-β1培養人支氣管上皮樣細胞16HBE。結果顯示，蟲草素抑制了TGF-β1誘導的人支氣管上皮樣細胞的增殖、遷移及EMT，進一步證實了蟲草素在哮喘中對EMT的抑制作用。

Smad蛋白是TGF-β調控系統的重要胞內效應器，可介導胞內信號傳導，促進靶基因轉錄。TGF-β/Smad信號通路是哮喘潛在的治療靶點[10]。抑制氣道上皮細胞Smad3的產生可抑制TGF-β1誘導的EMT，從而治療哮喘[11]。細胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)1/2信號通路參與調節哮喘、慢性氣道炎、氣道高反應性等氣道重塑過程[12]。在慢性哮喘大鼠模型中，ERK1/2高度激活[13]。c-Jun參與調節哮喘的氣道炎性反應和重塑，c-Jun通過與c-fos結合形成異源二聚體(activator protein 1, AP-1)復合體調節Th2細胞下游因子的表達并加重哮喘[14]。本研究中，蟲草素抑制了TGF-β1誘導的人支氣管上皮樣細胞中Smad3和ERK1/2信號通路的活化及c-Jun的表達，這可能是蟲草素治療哮喘的機制。

綜上所述，本研究表明蟲草素抑制哮喘中的EMT，其機制與對Smad3和ERK1/2信號通路及c-Jun的抑制有關。因此，蟲草素在治療哮喘方面具有較高的潛在應用價值。