miRNAs可能通過調(diào)控MAPK通路參與心室間隔缺損

江 輝，張 林

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

先天心臟病(congenital heart disease，CHD)指出生時由于心血管系統(tǒng)異?；虬l(fā)育障礙而引起的心血管畸形[1]。室間隔缺損(ventricular septaldefect，VSD)是 CHD最常見的癥狀之一，占 CHD的20%[2]。近年來，對VSD的分子調(diào)控和發(fā)病機(jī)制的研究受到了國內(nèi)外學(xué)者的重視，認(rèn)為從分子水平研究與心臟發(fā)育有關(guān)的染色體和基因變化，對于探索其發(fā)生機(jī)制具有重要意義[3]，但由于涉及的基因、途徑和機(jī)制復(fù)雜，VSD的發(fā)病機(jī)制尚不明確。

miRNA是一類非編碼、高度保守的RNA，其長度約18 nt[4]。它在心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞的增殖等過程中具有重要作用，可檢測血樣中miRNA表達(dá)水平的變化，并將其作為診斷和預(yù)測VSD的標(biāo)志分子[5]。本研究旨在通過miRNA表達(dá)譜技術(shù)檢測VSD患兒和健康嬰兒血樣，并對差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行整理分析，深入探究其與靶基因及相關(guān)信號通路之間的潛在聯(lián)系，進(jìn)一步闡明miRNAs在VSD中的表達(dá)在分子生物學(xué)中的角色。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選取浙江綠城心血管病醫(yī)院中經(jīng)胸部X片和心臟彩超診斷為單純型 VSD患兒5例，設(shè)為 VSD組；選取該院未患心臟疾病的健康嬰兒4例，設(shè)為正常組。所有血樣均經(jīng)浙江綠城醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20150029)，并告知血樣將用于研究目的，并取得所有涉及此研究患者或監(jiān)護(hù)人的同意。

1.1.2 試劑：PAXgeneTm采血管(Qiagen有限公司)；microRNA microarray-miRBase human 20.0版μParaflo?芯片；TaKaRaSYBR?Premix Ex TaqTm、RT-qPCR試劑盒TaKaRa PrimeScriptTmR(TaKaRa公司)；抗兔單抗血清、山羊抗兔血清IgG/HRP(艾碧康生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本的采集：參照PAXgeneTm采血管產(chǎn)品手冊的要求，采集VSD組和健康組中嬰兒的外周血液作為樣本，并保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 高通量測序分析miRNAs表達(dá)譜：miRNAs表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)操作由聯(lián)川公司杭州分公司進(jìn)行。對所得數(shù)據(jù)取中間值并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，分別計(jì)算VSD組和健康組的log2比值和t檢驗(yàn)的P值。對有顯著性差異表達(dá)的 miRNAs按log2的絕對比值大于1且P≤0.1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.2.3 靶基因的預(yù)測與分析：分別使用 miRbase、Targetscan和 Miranda等生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異表達(dá) miRNAs的靶基因。對獲得的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)Gene Ontology基因功能與富集分析。

使用集算器算法(esProc)將近年來已被研究證實(shí)與心臟發(fā)育密切相關(guān)的基因和預(yù)測靶基因進(jìn)行交集比對，并通過Cytoscape軟件對交集比對的結(jié)果和差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行互作分析。

1.2.4 靶基因信號通路的搜索：通過 KEGG和REACTOME通路數(shù)據(jù)庫檢索差異表達(dá)miRNAs靶基因參與的信號通路。利用Fisher’s法計(jì)算每條路徑的P值，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.2.5 RT-qPCR檢測關(guān)鍵通路中關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平：內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。使用RT-qPCR法檢測關(guān)鍵通路中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑TaKaRaSYBR? Premix Ex TaqTm和TaKaRaPrimeScriptTmRT的使用說明進(jìn)行。

1.2.6 Western blot檢測關(guān)鍵通路中關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)水平：Western blot檢測關(guān)鍵通路中關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)水平。洗凈條帶后加入顯影液進(jìn)行 ECL處理，利用顯像儀進(jìn)行曝光成像，并用Image J分析各蛋白相對表達(dá)。內(nèi)參蛋白為 GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的miRNAs列表

與健康組相比，有22個差異表達(dá)miRNA符合篩選要求。共有19個miRNA表達(dá)下調(diào)，3個miRNA表達(dá)上調(diào)(表1)。

并做出22個差異表達(dá)的miRNAs微陣列達(dá)譜熱聚圖(圖1)。

表1 差異表達(dá)的miRNAsTable 1 Differentially expressed miRNAs

The top showed the corresponding numbers of the samples in the normal group and the VSD group;from left to right, there were 4 normal groups and 5 VSD groups; the right side represented the names of 22 differentially expressed miRNAs; the color of the thermal aggregation graph indicated the expression level of miRNA in the sample, where the expression level from red to green gradually decreased; the miRNA cluster tree was located on the left side of the picture, and these 22 miRNAs were clustered

2.2 22種差異表達(dá)miRNA靶基因的預(yù)測結(jié)果

共獲得12 744個目的基因。由于每個miRNA對應(yīng)的靶基因數(shù)量過多，本文僅顯示部分靶基因(表2)。且大部分目的基因可能與心肌細(xì)胞分化、增殖，心臟生長發(fā)育密切相關(guān)。

2.3 與心臟發(fā)育相關(guān)的重點(diǎn)靶基因的篩選

整理得到61個已被證實(shí)與心臟發(fā)育有著密切聯(lián)系的相關(guān)基因(下簡稱：已知心臟發(fā)育相關(guān)基因)，并將其與預(yù)測的12 744個目標(biāo)基因進(jìn)行交集比對，發(fā)現(xiàn)其中NKX2-5、GATA6等50個已知心臟發(fā)育相關(guān)基因受到22個差異表達(dá)miRNA的調(diào)控。做出22個差異表達(dá)的miRNA與50個已知心臟發(fā)育相關(guān)基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。

2.4 靶基因信號通路分析結(jié)果

共獲得126條相關(guān)信號通路。通過對這126條信號通路的研究和分析，發(fā)現(xiàn)其中的MAPK通路與心臟發(fā)育密切相關(guān)，經(jīng)過進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNAs參與調(diào)控MAPK通路中的關(guān)鍵5個靶基因，分別為：神經(jīng)纖維蛋白1(neurofibromin 1，NF1)、Ras GTPase激活蛋白1(Ras GTPase-activating protein 1，RASA1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、腫瘤壞死因子受體超家族成員1A(tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A，TNFRSF1A)、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer factor 2C，MEF2C)(圖3)。

表2 22個差異表達(dá)miRNA與心臟發(fā)育相關(guān)的靶基因列表Table 2 List of 22 differentially expressed miRNA target genes related to heart development

Blue indicated 22 differentially expressed miRNAs, yellow indicated 50 known heart development-related genes, and the line indicates that there was a regulatory relationship between the two

The yellow box indicated the target gene that had been screened; among them, NF1 and RASA1 participated in the ERK sub-pathway, and MEF2C, TNF, and TNFRSF1A participated in the p38/MAPK sub-pathway

2.5 關(guān)鍵通路中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平

對健康組和VSD組的全血標(biāo)本關(guān)鍵通路(MAPK通路)中的10個關(guān)鍵基因NF1、 RASA1、TNF、 TNFRSF1A、MEF2C、Ras蛋白(Ras protein，Ras)、絲裂原激活的蛋白激酶激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1，MEK1)、絲裂原活化蛋白激酶1/3(mitogen-activated protein kinase1/3，ERK)、TNF受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)、p38 MAP激酶(p38 MAP kinase，p38)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(圖4)。

2.6 關(guān)鍵通路中關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)水平

對NF1、 RASA1、TNF、 TNFRSF1A、Ras、TRAF2的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測定。其中MEK1、ERK、p38、MEF2C分別測定其總蛋白和磷酸化(phospory-lation，p)蛋白的表達(dá)水平(圖5)。

2.7 差異表達(dá)的miRNAs與MAPK通路中關(guān)鍵靶基因間的關(guān)系

在22個差異表達(dá)的miRNA中有12個差異表達(dá)miRNA參與調(diào)控MAPK通路，有6個miRNA參與調(diào)控ERK通路中的2個靶基因(NF1、RASA1)；8個miRNA參與調(diào)控p38/MAPK通路中的3個靶基因(TNF、TNFRSF1A和MEF2C)(圖6)。

并做出12個差異表達(dá)miRNA和5個關(guān)鍵靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)。

3 討論

本研究利用miRNAs表達(dá)譜芯片檢測VSD組與健康對照組全血樣本，共獲得22個差異表達(dá)miRNA，其調(diào)控的靶基因中有50多個已知基因?qū)π呐K發(fā)育有重要影響。

*P<0.05, **P<0.01 compared with normal圖4 健康組和VSD組關(guān)鍵通路中關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平Fig 4 Transcription levels of key genes in key pathways in the normal group and the VSD group

*P<0.05, **P<0.01 compared with normal圖5 健康組和VSD組關(guān)鍵途徑中關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)水平Fig 5 Protein expression levels of key genes in the key pathways of the normal group and VSD group

進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其中12個表達(dá)異常miRNAs可導(dǎo)致MAPK通路異常。MAPK家族是絲/蘇氨酸蛋白激酶的一種，有ERK、JNK、p38/MAPK 3條子通路[6]。本研究發(fā)現(xiàn)RASA1、NF1、TNF、TNFRSF1A、MEF2C 5個靶基因參與ERK和p38/MAKP通路。

ERK通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞對外部壓力和其他生理過程的反應(yīng)中起重要作用。在ERK通路中，Ras蛋白是其中的核心蛋白，涉及增殖、分化、蛋白合成等功能[7]。當(dāng)受到外界鳥苷酸交換因子刺激時， Ras與GTP結(jié)合形成激活狀態(tài)[8]，通過磷酸化修飾增強(qiáng)BRAF、ARAF基因的表達(dá)，激活RAF激酶。激活的RAF激酶又能通過磷酸化修飾激活MEK，MEK不僅能夠作為ERK的活化劑, 也能作為ERK的細(xì)胞質(zhì)錨定蛋白[9]。活化的MEK通過磷酸化修飾激活下游的ERK促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂增殖周期，在細(xì)胞分化、增殖中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10]。活化的ERK可以促進(jìn)Fos蛋白的表達(dá)，在胞質(zhì)內(nèi)形成后迅速進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化。在ERK通路的一系列激活過程中，Ras蛋白占據(jù)著重要地位，但其受到NF1和RASA1兩個基因的負(fù)調(diào)控作用。本研究檢測了ERK通路中的NF1、RASA1、Ras、MEK1、ERK等5個關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示ERK通路被抑制。

A.indicated the ERK pathway; B.indicated the p38/MAPK pathway; the red box represented the target gene, and the blue box represented the differentially expressed miRNA that regulated the target gene

The blue indicated the differentially expressed miRNAs, the yellow indicated the target gene, and the line indicated the regulatory relationship between the two圖7 12個表達(dá)差異的miRNA和關(guān)鍵靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig 7 Regulatory network diagram of 12 differentially expressed miRNAs and key target genes

MAPK通路的另一條子通路為p38/MAPK通路，其生理過程為：當(dāng)TNF與TNFRSF1A胞外區(qū)結(jié)合時，引起TNFRSF1A的三聚化，其胞內(nèi)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域與腫瘤壞死因子受體1型相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein，TRADD)相結(jié)合[11]，進(jìn)一步與TRAF2的TRAF結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，進(jìn)而招募聚集絲裂原激活的蛋白3激酶5(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5，ASK1)[12]。大量集聚活化的ASK1、ASK2等可以通過一系列磷酸化作用激活p38。p38是MAPKs家族成員，是一種促進(jìn)炎性激酶應(yīng)激活化的酶[13]，當(dāng)其被激活后，可通過磷酸化修飾激活多種轉(zhuǎn)錄因子，如MEF2C、p53等，這些核轉(zhuǎn)錄因子可進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)炎性因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生級聯(lián)式炎性瀑布反應(yīng)，引起心肌細(xì)胞凋亡。本研究檢測了p38/MAPK通路中的TNF、TNFRSF1A、TRAF2、p38、MEF2C等5個關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示p38/MAPK通路被激活。

綜上所述，12個差異表達(dá)miRNA顯著下調(diào)，對5個靶基因的抑制作用減弱，繼而造成5個靶基因的表達(dá)上調(diào)。在ERK通路中，NF1和RASA1的表達(dá)上調(diào)，負(fù)調(diào)控該通路核心蛋白Ras蛋白的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致ERK通路被抑制，心肌細(xì)胞分化受到抑制。而在p38/MAPK通路中TNF、TNFRSF1A的表達(dá)上調(diào)過度激活p38/MAPK通路，導(dǎo)致MEF2C等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上升，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。因此，上述兩條子通路的異常，可能是導(dǎo)致VSD發(fā)生的關(guān)鍵因素。