羧胺三唑乳清酸鹽抑制人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株增殖及線粒體能量代謝

陳秋霞，楊黎星，馬 瑞，趙永晶，王鈺鋮，鞠 瑞，郭 磊

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 藥理系，北京 100005)

胰腺癌(pancreatic cancer)是一種高度致命的惡性腫瘤，被診斷后患者5年內的生存率在10%左右[1]。由于患者在癌早期階段癥狀表現不明顯，因此胰腺癌的早期診斷非常困難，即使通過手術治療后，預后情況也比較差。目前，胰腺癌的治療手段包括手術切除、輔助化學治療及免疫治療等[2]。吉西他濱則是術后輔助化學治療的標準一線化學治療藥物，但是吉西他濱耐藥問題日益成為胰腺癌輔助化學治療的突出問題。因此，探索克服胰腺癌吉西他濱耐藥的方法和策略對人類的生命健康具有重要意義[3]。

羧胺三唑乳清酸鹽(carboxyamidotriazole-oro-tate，CTO)是小分子抗腫瘤藥物羧胺三唑的乳清酸鹽形式。羧胺三唑是一種非電壓性鈣通道和鈣通道介導的信號通路的細胞抑制劑，具有抗癌，抗感染活性和抗血管生成作用[4]。研究表明羧胺三唑能夠抑制線粒體復合物I活性，降低腫瘤細胞氧化磷酸化水平從而抑制腫瘤細胞增殖[5]。產生化學耐藥性的胰腺癌細胞的代謝方式則發生明顯重編程現象，較對細胞毒類藥物敏感的胰腺癌細胞，產生化學耐藥性的胰腺癌細胞則有更高的糖酵解水平,而先天性耐藥的胰腺癌腫瘤干細胞則有更高的氧化磷酸化水平[6]。目前，CTO對胰腺癌吉西他濱耐藥細胞的影響尚不明確。本研究旨在探索胰腺癌耐藥株和敏感株在能量代謝上的差異以及CTO對胰腺癌耐藥細胞增殖和凋亡的影響，初步探究CTO在干擾胰腺癌耐藥株能量代謝上的作用機制，為進一步優化胰腺癌耐藥問題的解決方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞株：人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株ASPC-1-GEM(哈靈生物,以下簡稱為AG細胞)。

1.1.2 藥品與試劑：CTO(MCE公司)；DMSO(Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)；胎牛血清(Gibco公司)；磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B, SRB)細胞增殖和毒性檢測試劑盒、annexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；XF Mito Stress Test Kit(Agilent公司)；NAD+/NADH檢測試劑盒(BioAssay公司)。兔抗LC3-Ⅱ單克隆抗體和兔抗P62抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及分組處理：15%胎牛血清DMEM高糖培養基,在5% CO2、37 ℃的培養箱中培養AG細胞。實驗分組為：對照組(control組)；給藥組(CTO)，CTO用DMSO配制成40 mmol/L母液,后用DMEM培養基配制不同終濃度CTO處理細胞。

1.2.2 SRB法檢測細胞活力：用DMEM高糖培養基進行AG細胞培養與傳代。在96孔板中接種AG細胞懸液，調整細胞為2×106個/mL,每孔100 μL，分組給藥，給藥組以20和40 μmol/L CTO給藥，培養48和72 h。隨后棄去孔中的培養液，按照SRB檢測試劑盒說明書操作，用酶標儀上機檢測激發波長在515 nm處的吸光度值，并依據吸光度值計算細胞存活率。計算公式為存活率=(A-A空白)/(Acon-A空白)×100%。

1.2.3 CFSE染色及流式細胞儀檢測細胞分裂速度：用無血清的DMEM(高糖)培養基配制5 μmol/L的CFSE工作液備用。準備1 mL AG細胞懸液，用不含血清的DMEM(高糖)培養基調整細胞濃度至1.0×106個/mL。取500 μL細胞懸液至15 mL離心管中，加入適量濃度的CFSE工作液。將離心管放入37 ℃培養箱中15～30 min。離心去上清，加入2 mL PBS溶液，重懸細胞，再離心去上清。加入DMEM(高糖)培養基制成細胞懸液，重新種板并分組給藥，藥物處理之后收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞分裂，激發波長為488 nm。

1.2.4 Annexin V/PI雙染色及流式細胞儀檢測細胞凋亡：取對數增殖期的AG細胞接種于中皿中，2.0×105個/孔，隔天分組給藥。藥物作用48 h后收集細胞，PBS洗3遍。按照細胞凋亡試劑盒說明書操作，室溫避光孵育10～15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡，激發波長為488 nm。

1.2.5 MTT法檢測細胞內NAD+、NADH含量：取對數增殖期的AG細胞接種于10 cm培養皿中，2.0×106個/皿，隔天分組給藥，藥物作用6 h后，收集細胞，調整各組細胞數目一致。按照NAD+/NADH檢測試劑盒說明書操作，用酶標儀測定565 nm處的吸光度(A)值。

1.2.6 Seahorse生物能量實驗檢測細胞耗氧速率(oxygen consumption rate,OCR):取對數增殖期的AG細胞接種于24孔板中，1×105個/孔，隔天給藥，給藥組以20 μmol/L CTO給藥。藥物作用6 h后按照XF Mito Stress檢測試劑盒的說明書進行操作，使用Seahorse XF分析儀上機檢測。

1.2.7 Western blot檢測細胞自噬相關蛋白表達：取對數增殖期的AG細胞接種于6 cm培養皿中，5×105個/皿，隔天給藥，給藥組以20 μmol/L CTO給藥。藥物給藥48 h后提取蛋白，并將提取出的蛋白溶液進行BCA蛋白定量。之后用Western blot檢測相關蛋白表達，具體步驟包括：SDS-PAGE、轉膜、雜交與封閉、化學發光與成像，用Image J軟件進行吸光度值分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CTO抑制AG細胞存活

AG細胞與CTO共同孵育48和72 h后，與對照組相比，細胞存活率呈時間-劑量依賴性明顯降低(P<0.05，P<0.01和P<0.001)(圖1)。

2.2 CTO減緩AG細胞分裂

20 μmol/L CTO組熒光強度明顯右移，平均熒光強度明顯高于對照組(P<0.05)(圖2)。

2.3 CTO促進AG細胞凋亡

與對照組相比，10、20和40 μmol/L CTO組早期凋亡的細胞比例隨著藥物濃度明顯增加,20、40 μmol/L CTO組晚期凋亡的細胞比例隨著藥物濃度明顯增加(P<0.05或P<0.01)(圖3)。

2.4 CTO升高AG細胞內NADH含量，降低NAD+/NADH比值

與對照組相比，20、40 μmol/LCTO組AG細胞內NADH的量隨著劑量的增加顯著升高(P<0.05或P<0.001)。與對照組相比，20、40 μmol/L CTO組AG細胞內NAD+/NADH的比值隨著劑量的增加明顯降低(P<0.01)(圖4)。

A.bar graph of survival rate of AG cells after being treated with CTO for 48 hours; B.bar graph of survival rate of AG cells after being treated with CTO for 72 hours; *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 compared with control group

A.division rate of AG cells by flow cytometry; B.bar graph of mean fluorescence intensity in AG cells after being staining with CFSE; *P<0.05 compared with control group

A.apoptosis of AG cells by flow cytometry; B.bar graph of early and late apoptotic AG cells; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

2.5 CTO能夠抑制AG細胞線粒體呼吸

在Seahorse生物能量實驗中，與對照組相比，20 μmol/L CTO組AG細胞的OCR降低，基礎呼吸值、剩余呼吸能力和最大呼吸值都明顯降低(P<0.05)(圖5)。

2.6 CTO降低AG細胞的LC3-Ⅱ、P62蛋白表達

與對照組相比，CTO給藥組明顯降低AG細胞內LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(P<0.05)(圖6)。

A.concentration of NADH in AG cells after being treated with CTO for 6 hours; B.concentration of NAD+ in AG cells after being treated with CTO for 6 hours; C.the radio of NAD+/NADH in AG cells;*P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.OCR data of AG cells after being treated with CTO for 6 hours; B.bar graph of basal respiration; C.bar graph of spare respiratory capacity; D.bar graph of maximal respiration;*P<0.05 compared with control group

3 討論

羧胺三唑是一種具有抗腫瘤作用的小分子化合物，而羧胺三唑的乳清酸鹽形式(CTO)能夠增加羧胺三唑的生物利用度，提高羧胺三唑的血藥濃度，從而達到低細胞毒性的效果[7]。本研究證實了CTO能夠通過減緩細胞分裂速率和促進細胞凋亡來抑制AG細胞增殖，并且呈時間-劑量依賴性。

胰腺癌發展進程中廣泛的代謝重編程與治療抗性有密切關系，這種代謝復雜性使胰腺癌細胞在各種應激環境下通過線粒體呼吸獲取能量，保持存活。而有關不同亞群的胰腺癌細胞的代謝異質性已有相關報道。非胰腺癌腫瘤干細胞是高度糖酵解依賴的，但胰腺癌腫瘤干細胞依賴于氧化磷酸化代謝 (oxidative phosphorylation，OXPHOS)[8]。因此，線粒體呼吸成為腫瘤治療上的一個新興靶點。本實驗室前期多項研究結果表明，羧胺三唑能夠抑制多種腫瘤細胞的線粒體呼吸[9-10]。本研究繼續探究CTO對胰腺癌吉西他濱耐藥細胞線粒體呼吸的作用，結果顯示CTO能夠降低AG細胞OCR、基礎呼吸值、最大呼吸值和剩余呼吸能力，并且能夠呈劑量依賴性地增加胞內NADH的含量，降低NAD+/NADH比值，提示CTO能夠影響AG細胞線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)復合物I對NADH的利用，造成細胞內NADH蓄積抑制線粒體功能。已有文獻報道，在卵巢癌中對順鉑產生多藥耐藥性的腫瘤細胞有更高的自噬水平，自噬一定程度上也維持腫瘤細胞耐藥性[11]。自噬與線粒體功能密切相關，在關于炎性反應的研究中表明線粒體功能障礙能夠誘發細胞自噬水平降低，從而加速細胞凋亡和壞死[12]。為了探究CTO作用之后線粒體功能障礙對AG細胞自噬水平的影響，通過Western blot實驗驗證CTO作用之后LC3-Ⅱ、P62在AG細胞中表達減少，提示CTO對AG細胞的自噬水平也有影響。

A.expression of LC3-Ⅱ,P62 proteins by Western blot; B.bar graph of LC3-Ⅱ, P62 proteins expression; *P<0.05 compared with control group

綜上所述，本研究初步證實CTO通過破壞線粒體呼吸功能造成胞內NADH蓄積，減緩AG細胞分裂速率誘導AG細胞凋亡，降低自噬相關蛋白表達從而抑制AG增殖細胞。本研究為進一步探索在胰腺癌耐吉西他濱治療方法提供實驗依據，但同時也存在一定的局限性。自噬與腫瘤細胞的增殖有密切關系，本文關于CTO對AG細胞自噬的影響探討較淺，將會在日后進一步完善自噬與AG耐藥性及CTO減少AG自噬相關蛋白表達的機制探索。