多組學分析發現LAMC2是調節泛癌微環境的關鍵因子

蘇路瑛，黃 容，鄒定峰，許 富，李 凱，盧 艷，繆時英，王琳芳，宋 偉

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 醫學分子生物學國家重點實驗室, 北京 100005)

層黏連蛋白γ2(γ2 laminin, gamma 2，LAMC2)與其他兩條鏈一起組成了多黏連蛋白-332。LAMC2位于染色體1q25-q31上[1]。LAMC2作為一個配體蛋白，它通過調節腫瘤微環境與其幾個細胞表面受體ITGA3(integrin subunit alpha 3)、ITGA6(integrin subunit alpha 6)、ITGB1(β1-integrin)、ITGB4(integrin subunit beta 4)、ITGA2(integrin subunit alpha 2)、CD151(CD151 antigen)、COL17A1(collagen type ⅩⅦ alpha 1 Chain)的相互作用來驅動腫瘤發生。它可能作為抑制腫瘤發生的潛在抗癌治療靶點。LAMC2高表達往往與人類腫瘤的總生存率差、早期復發和轉移相關。它會影響正常細胞以及腫瘤細胞的分化、遷移和黏附，以及表型和存活[2-4]。并且LAMC2可能作為侵襲性腫瘤的特異性標志物[2, 5]。

盡管研究顯示，LAMC2在多種腫瘤中均有促癌的作用。但仍缺乏泛癌相關分析。因此，本研究運用多種數據庫對LAMC2的功能進行了系統分析，利用多組學數據證明LAMC2是影響患者腫瘤發生和臨床預后的關鍵分子，也是泛癌微環境中的關鍵調控因子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象：將2018年9月1日至2020年12月31日就診于中國醫學科學院腫瘤醫院肝膽外科的4例胰腺癌患者作為本次研究對象，本課題入組患者的入選均為病理確診為胰腺癌患者，簽署知情同意書并接受手術治療。年齡在48～75(63.72±7.27)歲。 本研究通過經國家腫瘤中心/腫瘤醫院倫理委員會、中國醫學科學院、北京協和醫學院審核(21/197-2868號)。

1.1.2 主要試劑：自發熒光淬滅劑、488山羊抗小鼠熒光二抗、CY3標記山羊抗兔熒光二抗、含DAPI封片劑(均Servicebio公司)，LAMC2一抗(Abcam公司)，CD151一抗(Immunoway公司)。

1.2 方法

1.2.1 LAMC2表達的泛癌分析：使用TCGA門戶網站GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析TCGA基因表達數據[6]。使用GEPIA2獲取TCGA的32種腫瘤類型的RNAseq測序數據和配套的臨床信息，進行不同癌組織與癌旁組織差異基因的分析，并且根據腫瘤分期、分級、患者種族、體質量及其他各種臨床病理特征分組，依據分組計算LAMC2基因表達量。所有的表達量數據都進行對數轉換，并以每個數組的中位數為中心，進行標準差歸一化。圖中紅色代表腫瘤樣本LAMC2的RNA表達量，藍色代表正常樣本LAMC2的RNA表達量。

1.2.2 LAMC2在腫瘤單細胞測序中的表達研究：單細胞測序技術通常用來解析腫瘤微環境中細胞組分與互作情況，從而篩選出腫瘤潛在的治療靶點。因此使用TISCH(http://tisch.comp-genomics.org/)分析不同腫瘤單細胞測序數據[7]。挖掘LAMC2在單細胞數據中的主要表達細胞群及表達量并進行可視化。在UMAP圖中用灰色至藍色表示每個細胞LAMC2的表達量。

1.2.3 LAMC2的細胞表達位置分析：使用Reactome、Ensembl、Gene Ontology分析LAMC2在細胞上的表達位置，并使用swissbiopics(https://www.swissbiopics. org)在線作圖工具作圖。

1.2.4 LAMC2蛋白表達量：使用HPA(human protein atlas)(https://www.proteinatlas.org)數據庫檢索LAMC2在各種腫瘤組織及正常組織中亞細胞中定位、在各組織中的表達情況以及免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色結果。使用Prism 7 formac軟件(SanDiego，CA，USA)對數據庫中不同腫瘤組織IHC陽性程度進行統計。

1.2.5 LAMC2蛋白組學表達數據：登錄到交互式網絡資源UALCAN門戶網站( http：//ualcan.path. uab. edu/analysis-prot.html)[8]，并應用“CPTAC分析”模塊研究蛋白表達水平。在每個蛋白質組學譜中，CPTAC數據庫將記錄的表達值歸一化到與中位數的標準差。通過檢索“LAMC2”,比較腫瘤和正常組織中LAMC2總表達水平。選取10種腫瘤的現有數據集，包括卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、透明細胞腎細胞癌、肺腺癌和胰腺癌等。

1.2.6 LAMC2胰腺癌組織石蠟切片免疫熒光：提前一晚將石蠟切片放置于50 ℃烘箱中，讓石蠟融化后將胰腺癌石蠟切片梯度脫蠟。隨后組織切片置于盛滿乙二胺四乙酸(EDTA)(pH=8.0)抗原修復液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復15 min。待玻片自然冷卻，將玻片洗滌后用組化筆在組織周圍畫圈，加入自發熒光淬滅劑5 min，并用流水沖洗。在組畫筆圈內滴加5%的牛血清白蛋白(BSA)，于室溫封閉30 min。使用PBS緩沖液(pH=7.4)將LAMC2抗體按1∶200稀釋，LAMC2的受體CD151按1∶100稀釋。滴加抗體至玻片上，4 ℃孵育過夜。玻片洗滌甩干后在圈內滴加一滴按1∶500配制的488山羊抗鼠與594山羊抗兔熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育60 min后洗滌。最后玻片用含DAPI的封片劑封片，蓋上蓋玻片。待玻片干透后，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 腫瘤免疫微環境分析：使用TIMER(https:// cistrome.shinyapps.io/timer/)進行不同腫瘤的LAMC2表達量與免疫細胞組分浸潤分析[9]。

2 結果

2.1 LAMC2的RNA表達情況

分析LAMC2在TCGA不同腫瘤類型癌組織與正常組織中的表達量(圖1)。LAMC2在大多數腫瘤組織中的表達水平均顯著升高(P<0.05)，其中包括膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)，宮頸鱗癌和腺癌(cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC)，彌漫性大B細胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC)，結腸癌(colon adenocarcinoma，COAD)，食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)，頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)，腎乳頭狀細胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)，肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)，卵巢漿液性囊腺瘤(ovarian serous cystadenocarcinoma，OV)，胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)， 前列腺癌(prostate adenocar-cinoma，PRAD)，直腸腺癌(rectum adenocarcinoma，READ)，胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)，睪丸生殖細胞癌(testicular germ cell tumors，TGCT)，甲狀腺癌(thyroid carcinoma，THCA)，胸腺瘤(thymoma，THYM)，子宮體內膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)，子宮癌肉瘤(uterine carcinosarcoma，UCS)。只有在腎嫌色細胞癌(kidney chromophobe，KICH)，腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)，皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma，SKCM)這3種腫瘤中與相鄰的正常組織相比，LAMC2在腫瘤的表達量顯著低于正常組織(P<0.05)。

Dotplot of genes expression in different tissue; tumor names in red indicate high gene expression; tumor names in green indicate low gene expression

熱圖表示每種腫瘤組織中LAMC2的表達量(圖2A)，紅色越深，代表表達量越高。其中，在基底細胞癌(basal cell carcinoma,BCC)，膽管癌(cholangiocarcinoma,CHOL)，結腸癌(colon cancer,CRC)，頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)，非小細胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma，OV)，胰腺癌(pancreatic adenocar-cinoma，PAAD)中主要在惡性腫瘤細胞中表達。單獨選用這幾種腫瘤進行分群(圖2B)，其中藍色越深代表LAMC2表達量越高。結合Bulk RNA-seq與單細胞測序數據，發現LAMC2在結腸癌(CRC)、膽管癌(CHOL)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、非小細胞型肺癌(NSCLC)、卵巢癌(OV)和胰腺癌(PAAD)中是一個與腫瘤惡性潛在相關的基因。

2.2 LAMC2的蛋白表達情況

觀察到LAMC2既可作為分泌蛋白，也可作為膜蛋白，它分布在細胞的胞外區域或基底膜，細胞膜等位置上(圖3A)。

檢測了數據庫中44例正常組織的LAMC2蛋白表達(圖3B)。LAMC2蛋白在闌尾、乳房、支氣管、結腸、子宮內膜、輸卵管、鼻咽、扁桃體中均有中等水平表達，但在腎上腺、骨髓、尾狀、小腦、大腦皮層、子宮頸、十二指腸、附睪、食道、膽囊、心肌、海馬體、腎臟、肝、肺、淋巴結、口腔黏膜、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、胎盤、前列腺癌、直腸、精囊、皮膚、小腸、平滑肌、軟組織、脾、胃、睪丸和陰道中均未見表達。

A.LAMC2 expression in single cell sequencing data of human pan-carcinomatous tissues; B.expression of LAMC2 in single cell sequencing data of several human cancer tissues

A.expression of LAMC2 in human cells; B.expression intensity of LAMC2 protein in normal human tissues; C.LAMC2 protein expression ratio in human tumor tissues

LAMC2蛋白在大多數胰腺癌、皮膚癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌、甲狀腺癌、頭頸部癌、移行細胞癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌患者中表達。在前列腺癌、睪丸癌、良性腫瘤、肝癌、乳腺癌中均觀察到弱至中度的細胞質免疫反應性(圖3C)。在神經膠質瘤、腎癌、黑素瘤、淋巴瘤組織中均呈陰性染色。根據HPA數據庫中免疫組織化學的結果，發現胰腺癌與皮膚癌在癌組織中的表達量遠高于癌旁的表達量(圖4A,B)。選用了4例胰腺癌患者的胰腺癌組織石蠟切片進行免疫熒光染色驗證其在胰腺癌上的表達水平(圖4C)，其中綠色為LAMC2,紅色為LAMC2的受體CD151，藍色為DAPI。

最后，蛋白組學數據顯示，與正常組織相比，原發性乳腺癌、胰腺癌、子宮內膜癌和頭頸癌中總蛋白的表達水平增強(圖4D)。

2.3 多種腫瘤中LAMC2表達量與預后的關系

對TCGA中所有種類的腫瘤患者的預后進行了總生存期(overall survival,OS)分析。LAMC2高表達水平與較差的OS相關(圖5)。

2.4 LAMC2與免疫浸潤

腫瘤浸潤性免疫細胞是腫瘤微環境的主要組成部分，對腫瘤的發生、進展或轉移均有重要作用。因此，評估各種腫瘤中LAMC2基因表達與不同免疫細胞浸潤水平之間的潛在相關性(圖6)。通過研究發現，在結腸癌(COAD)、前列腺癌(PRAD)和直腸腺癌(READ)中觀察到LAMC2表達水平與浸潤CD8+T細胞水平呈正相關(rCOAD=0.258，rPRAD=0.216，rREAD=0.401，P<0.05) 。在結腸癌(COAD)，前列腺癌(PRAD)，甲狀腺癌(THCA)中與CD4+T細胞水平呈正相關 (rCOAD=0.281，rPRAD=0.1，rTHCA=0.568，P<0.05)。并且這幾種腫瘤也與其他免疫細胞例如B細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞水平相關。從分析中可以看出，LAMC2表達與免疫細胞浸潤之間的相關性模式在不同的腫瘤中明顯不同。因此LAMC2可能通過調節腫瘤微環境中的成分和免疫機制來影響抗腫瘤免疫。

A.expression intensity of LAMC2 protein in human tumor tissuesdatabase was measured by immunohistochemistry staining; B.immunohistochemistry of LAMC2 in several human tumortissuesand corresponding normal tissues; C. immunohistochemistry of LAMC2 in several human neoplasms and corresponding normal tissues; D. proteomics data of LAMC2 in several human tumor tissues and corresponding normal tissues

3 討論

目前，腫瘤仍是全球范圍內重要的公共健康安全問題，治療方式主要以手術、化療、放療以及藥物為主。目前提倡個體化精準治療，從而研發了很多分子靶向藥物，分子靶向藥物有療效顯著，副作用小等優點。但是腫瘤異質性極大制約著腫瘤精準治療。腫瘤異質性內在體現為分子表達譜的差異，外在表現為患者預后、復發等區別。目前腫瘤的精準治療由于存在腫瘤異質性問題，導致很多分子靶向藥療效個體差異較大，所以急需找到一個在患癌人群中廣泛適用的靶向藥物靶點。

圖5 LAMC2的表達與泛癌患者總生存期(OS)的相關性Fig 5 Correlation between LAMC2 expression and overallsurvival(OS) in patients with generalized carcinoma

以往文獻報道LAMC2在多種肝細胞癌和肺鱗狀細胞癌中過表達[2]。并且證明了LAMC2蛋白在胰腺、胃、舌、膀胱、陰道、宮頸、結直腸癌、肺癌、食管鱗癌以及黑色素瘤和間變性甲狀腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)中高表達[2]。本文通過TCGA數據庫挖掘LAMC2的Bulk RNA-seq的RNA表達水平發現，LAMC2的RNA在多數腫瘤中表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，并且通過單細胞數據解析了LAMC2在多種腫瘤中表達于惡性腫瘤細胞。因此推測LAMC2是與腫瘤惡性相關的基因。通過腫瘤免疫組織化學和蛋白質譜數據分析LAMC2的蛋白表達水平，證明其在多種腫瘤中表達量高于癌旁組織。并通過實驗證明LAMC2在胰腺癌微環境中與其受體一起發揮作用。

另外， 通過分析LAMC2表達與患者臨床預后間的關系，發現LAMC2的表達可能在部分腫瘤的預后中起重要作用。并且本研究解析LAMC2的基因改變和LAMC2的表達量與腫瘤免疫微環境中免疫細胞浸潤直接的關系。

圖6 LAMC2的表達與不同免疫細胞浸潤的相關性Fig 6 Correlation between LAMC2 expression and different immune cell infiltration

本研究全面分析了LAMC2在多種腫瘤中的作用，證明了LAMC2是一種重要的致癌基因，可能是有效治療腫瘤的重要靶點。通過研究，希望為LAMC2在人類腫瘤的發展、治療和預后中的作用提供新的見解。