陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿克隆在兒童重型再生障礙性貧血免疫抑制治療中的意義

李俊 宗蘇玉 尹梓溪 高洋洋 劉立鵬 萬揚 蘭洋 鞏曉文 竺曉凡

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），實驗血液學(xué)國家重點實驗室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300020）

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種以外周血細胞減少和骨髓造血細胞增生低下為特征的骨髓衰竭性疾病，異常免疫反應(yīng)在AA發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［1］。治療上，受限于造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）供者及費用等問題，以抗人胸腺細胞免疫球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）或抗人淋巴細胞免疫球蛋白（antilymphocyte globulin，ALG）聯(lián)合環(huán)孢素（cyclosporine A，CSA）為代表的聯(lián)合免疫抑制治療（immunosuppressive therapy，IST）仍占據(jù)重要地位。研究表明，接受IST的AA患兒有效率為30%～70%［2］。陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）克隆是一群表面缺少糖基磷脂酰肌醇的血細胞，由造血干細胞中PIGA基因突變導(dǎo)致的。國外研究報道約40%的AA患兒在初診時伴有PNH克隆［3］。AA患者中出現(xiàn)PNH克隆的機制尚未完全闡明，有研究認為在AA背景下，缺乏糖基磷脂酰肌醇的造血干細胞可逃避免疫細胞的殺傷，導(dǎo)致克隆擴增，因此PNH克隆也被認為是可預(yù)測IST療效的潛在指標(biāo)［4］。目前，多項研究結(jié)果均提示伴PNH克隆的成人AA患者對IST反應(yīng)較好［5-6］。但在兒童中，尚未獲得一致結(jié)果。此外，AA患者有進展為再生障礙性貧血-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（aplastic anemia-paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，AAPNH）綜合征的風(fēng)險［7］，PNH使治療更加困難，嚴(yán)重的溶血常危及生命。Narita等［8］報道AA患兒中AA-PNH綜合征的10年累積發(fā)病率為10.2%，初診時伴PNH克隆是進展為AA-PNH綜合征的危險因素，但國內(nèi)尚無研究探索兒童AA的PNH克隆演變及進展為PNH的情況。本研究回顧性分析我院151例重型再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）患兒的臨床資料，并通過傾向性評分匹配的方法控制混雜因素，探究PNH克隆在預(yù)測IST療效中的作用，并初步探索IST后PNH克隆的演變規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2012年1月至2020年4月我院收治的SAA患兒臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜18歲。（2）符合2014年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會血液學(xué)組《兒童獲得性再生障礙性貧血診療建議》中SAA或極重型再生障礙性貧血（very severe aplastic anemia，VSAA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］：SAA指①骨髓有核細胞增生程度25%～50%，殘余造血細胞少于30%或有核細胞增生程度低于25%。②外周血象至少符合以下3項中的2項：中性粒細胞絕對值＜0.5×109/L；血小板計數(shù)＜20×109/L；網(wǎng)織紅細胞絕對值＜20×109/L，或校正后的網(wǎng)織紅細胞百分率＜1%。VSAA指除滿足SAA條件外，中性粒細胞絕對值＜0.2×109/L。（3）接受ATG或ALG聯(lián)合CSA治療。（4）IST前均檢測PNH克隆。根據(jù)IST前PNH克隆狀態(tài)將患兒分為PNH克隆陽性組和PNH克隆陰性組。本研究已通過我院倫理委員會審查（IIT2021009-EC-1）。

1.2 PNH克隆檢測

分別采用流式細胞術(shù)和嗜水氣單胞菌溶素變異體（fluorescent aerolysin，F(xiàn)LAER）檢測外周血紅細胞和粒細胞PNH克隆，CD235a+CD59-細胞百分率為紅細胞PNH克隆大小，F(xiàn)LAER-CD24-細胞百分率為粒細胞PNH克隆大小。紅細胞或粒細胞PNH克隆大于1%即為PNH克隆陽性。PNH克隆擴增定義為任意1系PNH克隆較初診最高的1系增大1倍或以上。PNH克隆減小定義為任意1系PNH克隆較初診最高的1系減小1倍或以上。PNH克隆穩(wěn)定定義為PNH克隆變化未達到擴增及減小［10］。同時滿足以下4條診斷為AA-PNH綜合征：（1）2系PNH克隆≥10%；（2）酸溶血試驗陽性；（3）血漿結(jié)合珠蛋白降低伴或不伴血漿游離血紅蛋白增高；（4）血清乳酸脫氫酶活性增高［11］。

1.3 治療方案

兔抗人胸腺細胞球蛋白（美國Genzyme公司）2.5～3.5 mg/(kg·d)×5 d或豬抗人淋巴細胞球蛋白（武漢生物制品研究所）20 mg/(kg·d)×5 d。予甲潑尼龍預(yù)防血清病，劑量為1 mg/(kg·d)×5 d，并在15～21 d內(nèi)逐漸減停。CSA初始劑量為3～5 mg/(kg·d)，根據(jù)血藥濃度調(diào)整劑量，維持血藥濃度在100～200 ng/mL，連續(xù)使用至少2年［12］。成分輸血維持血紅蛋白≥60 g/L，血小板計數(shù)≥10×109/L。

1.4 療效評價

完全緩解（complete response，CR）定義為同時滿足血紅蛋白≥120 g/L，中性粒細胞絕對值≥1.5×109/L，血小板計數(shù)≥100×109/L，并維持3個月以上。部分緩解（partial response，PR）定義為脫離紅細胞及血小板輸注3個月以上，且血常規(guī)好轉(zhuǎn)不再滿足SAA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但未達CR。未緩解（no response，NR）定義為未達到以上CR及PR標(biāo)準(zhǔn)、IST后6個月仍NR行HSCT或死亡。分別在IST后的3、6、12、24個月評價療效，總有效率（overall response rate，ORR）為各組中達到CR和PR者所占的比例。疾病復(fù)發(fā)定義為達PR或CR患兒出現(xiàn)血紅蛋白、中性粒細胞、血小板水平下降，表現(xiàn)為輸血依賴或再次符合SAA診斷標(biāo)準(zhǔn)［13］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用R軟件4.0.2進行數(shù)據(jù)處理。非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)或百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。使用R語言函數(shù)包“Matching”進行傾向性評分匹配，匹配因素為基線資料中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量，采用1∶2臨近匹配法進行匹配，卡鉗值設(shè)為0.2。采用logrank法檢驗組間累積緩解率及AA-PNH綜合征累積發(fā)病率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

共納入151例患兒，男性72例（47.7%），女性79例（52.3%），中位年齡為5.0（3.5，9.0）歲。16例（10.6%）患兒PNH克隆陽性，男、女各8例，中位年齡為10（7，11）歲，2例患兒粒細胞和紅細胞均檢測到PNH克隆，其余14例僅檢測到粒細胞PNH克隆，中位粒細胞克隆大小為1.8%（1.3%，3.5%）。PNH克隆陽性組患兒的初診年齡和網(wǎng)織紅細胞絕對值高于PNH克隆陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。傾向性評分匹配后，PNH克隆陰性組28例，PNH克隆陽性組14例，中位粒細胞克隆大小為1.8%（1.2%，2.2%）。兩組在性別、初診年齡、疾病嚴(yán)重程度、發(fā)病至IST時間，以及初診時血紅蛋白水平、網(wǎng)織紅細胞絕對值、白細胞計數(shù)、中性粒細胞絕對值、血小板計數(shù)間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 PNH克隆陽性組和PNH克隆陰性組傾向性評分匹配前后的臨床特征 ［M（P25，P75）］或［例（%）］

2.2 IST療效對比

兩組患兒中位隨訪時間為44（25，68）個月。IST后3、6、12、24個月的ORR分別為31%（13/42）、60%（25/42）、71%（29/41）、73%（27/37）。IST后3個月，兩組ORR差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；IST后6、12、24個月PNH克隆陰性組的ORR均高于PNH克隆陽性組（P＜0.05）（表2）。在隨訪期間，14例PNH克隆陽性組中，共6例（43%）達PR或CR，4例（29%）行HSCT。28例PNH克隆陰性組中，共23例（82%）達PR或CR，3例（11%）行HSCT。以達到PR或CR為終點事件，PNH克隆陽性組和PNH克隆陰性組患兒的12個月累積緩解率分別為50.0%（95%CI：15.6%～70.4%）和82.1%（95%CI：60.5%～91.9%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

表2 IST療效比較 ［例（%）］

2.3 PNH克隆演變

共120例患兒有至少2次PNH克隆檢測結(jié)果。15例PNH克隆陽性患兒，6例（40%）患兒在IST后PNH克隆轉(zhuǎn)陰，其中5例在6個月內(nèi)轉(zhuǎn)陰；1例（7%）患兒PNH克隆減小；6例（40%）患兒出現(xiàn)PNH克隆擴增；2例（13%）患兒PNH克隆保持穩(wěn)定，見圖2。105例PNH克隆陰性患兒，4例（3.8%）患兒PNH克隆轉(zhuǎn)陽，其中3例在IST后3個月內(nèi)轉(zhuǎn)陽；1例于IST后20個月轉(zhuǎn)陽，轉(zhuǎn)陽后粒細胞、紅細胞的中位克隆大小分別為1.93%（1.73%，2.19%）和0%（0%，0.25%）。

2.4 AA-PNH綜合征進展情況

共3例患兒進展為AA-PNH綜合征，均為IST前已存在PNH克隆者，進展分別發(fā)生于IST后的3、13、33個月，進展時粒細胞克隆大小分別為22.2%、18.7%和75.0%，紅細胞克隆大小分別為18.9%、38.8%和31.6%。PNH克隆陽性組AA-PNH綜合征的3年累積發(fā)病率增加［32.1%（95%CI：0.0%～58.6%）vs 0.0%，P=0.01］（圖3）。患兒進展之初均無PNH相關(guān)臨床表現(xiàn)，在行溶血相關(guān)檢測時診斷，僅1例患兒在IST后25個月進展為經(jīng)典型PNH，表現(xiàn)為乏力、間斷醬油色尿、血紅蛋白下降。

3 討論

本研究中，10.6%的SAA患兒初診時伴PNH克隆，大多數(shù)患兒僅粒細胞克隆陽性，只有2例患兒同時檢測到粒細胞和紅細胞克隆，可能與SAA患兒頻繁輸血有關(guān)。目前紅細胞PNH克隆的測定主要通過檢測紅細胞表面CD59的表達，當(dāng)患兒頻繁輸血或有溶血發(fā)作時，可導(dǎo)致紅細胞克隆檢測偏小或假陰性，因此有條件時應(yīng)同時檢測粒細胞PNH克隆。粒細胞PNH克隆檢測目前多采用FLAER，且不受輸血和溶血的影響，能夠更準(zhǔn)確地反映PNH克隆的真實大小［14］。值得注意的是，任何方法都對檢測細胞數(shù)有一定要求，對于SAA患兒，嚴(yán)重血細胞減少也可能導(dǎo)致結(jié)果假陰性，因此對于初診時不伴PNH克隆者也應(yīng)定期復(fù)查。

本研究顯示，伴PNH克隆的AA患兒初診年齡偏大，網(wǎng)織紅細胞絕對值更高。通過傾向性評分匹配平衡組間的混雜因素后，伴PNH克隆是影響IST療效的不利因素。此外，本研究初步揭示了IST后PNH克隆演變的規(guī)律，并發(fā)現(xiàn)伴有PNH克隆易進展為AA-PNH綜合征。

近期，2項薈萃分析的結(jié)果均表明伴PNH克隆的成人AA患者對IST反應(yīng)較好，但在兒童患者亞組分析中，2組緩解率差異無統(tǒng)計學(xué)意義［15-16］。Yoshida等［17］前瞻性研究中，PNH克隆陽性并不影響SAA患兒IST的反應(yīng)率。Timeus等［18］研究發(fā)現(xiàn)存在PNH克隆陽性者療效較差。而Narita等［3］相關(guān)研究結(jié)果則相反，該現(xiàn)象可能與相關(guān)研究中存在較多混雜因素相關(guān)。本研究使用傾向性評分匹配對混雜因素進行控制，很大程度上增強了2組的可比性。另外，不同研究PNH克隆檢測閾值也存在差異，如Narita等［3］研究中，PNH克隆檢測閾值低至0.001%，可在42%的初診AA患兒中檢測到PNH克隆，紅細胞和粒細胞中位克隆大小分別為0.001%和0%，該研究中伴PNH克隆患兒比例顯著高于本研究，克隆明顯偏小。但微小PNH克隆（＜1%）的臨床意義目前尚不明確，盡管有研究表明PNH克隆的擴增是源于其對異常免疫殺傷的逃逸［4］，但克隆擴增定義的具體比例目前仍無定論。有研究提出“中性隨機漂移理論”，從另一個角度詮釋PNH的發(fā)病機制［19-20］。因此，PNH克隆的檢測仍需規(guī)范，其病理生理學(xué)機制還有待研究，臨床意義需要大規(guī)模臨床與基礎(chǔ)研究進一步驗證。

Scheinberg等［21］報道在接受IST后，成人和兒童患者PNH克隆均明顯減小，PNH克隆轉(zhuǎn)陽及進展為AA-PNH綜合征并不常見。Bat等［22］認為IST對抑制PNH克隆擴增有效果。但本研究中PNH克隆擴增及轉(zhuǎn)陰的患兒數(shù)量相當(dāng)，且50%PNH克隆擴增患兒進展為AA-PNH綜合征，可見IST并不一定總是抑制PNH克隆擴增，因此若PNH克隆在IST后有擴增趨勢應(yīng)提高警惕。75%PNH克隆轉(zhuǎn)陽和83%克隆轉(zhuǎn)陰發(fā)生在IST后6個月內(nèi)，提示IST后6個月內(nèi)對PNH克隆的監(jiān)測可能有重要意義。

國際PNH臨床隊列研究顯示，乏力是PNH最常見癥狀。相較于PNH，AA-PNH綜合征較少出現(xiàn)腹痛、吞咽障礙及血紅蛋白尿等癥狀，血栓事件也較少發(fā)生，但預(yù)后卻更差，10年總生存率為74%［23-24］。本研究中，兒童AA-PNH綜合征起病隱匿，典型臨床表現(xiàn)少見，血紅蛋白水平波動輕微，非特異性癥狀往往容易被忽視。因此對存在PNH克隆的患兒，監(jiān)測酸溶血試驗、血清乳酸脫氫酶、血漿結(jié)合珠蛋白和游離血紅蛋白可早期發(fā)現(xiàn)疾病進展。研究顯示依庫珠單抗可有效減少AA-PNH綜合征患者溶血和血栓事件的發(fā)生［25］，但PNH克隆可能持續(xù)擴增，停藥有發(fā)生突破性溶血風(fēng)險，且兒童用藥經(jīng)驗不足。目前HSCT是唯一可能治愈PNH的手段，隨著HSCT技術(shù)的進展，以及考慮到兒童長期的生存，對于反復(fù)溶血的AA-PNH綜合征患兒，HSCT或許是更好的選擇。

綜上，SAA患兒應(yīng)同時檢測紅細胞和粒細胞PNH克隆，并定期復(fù)查，尤其是IST后6個月內(nèi)。伴PNH克隆的SAA患兒對IST反應(yīng)欠佳，進展為AA-PNH綜合征的風(fēng)險顯著增高，需謹慎選擇治療方案；除PNH克隆變化外，還應(yīng)當(dāng)監(jiān)測酸溶血試驗、血漿結(jié)合珠蛋白和游離血紅蛋白以便及早發(fā)現(xiàn)疾病進展，尤其是當(dāng)血紅蛋白出現(xiàn)明顯下降時。目前對兒童AA-PNH綜合征治療及預(yù)后的相關(guān)報道仍非常有限，關(guān)于干預(yù)時機、治療方案選擇等問題，還有賴于大樣本、長時間的隨訪觀察，以及基礎(chǔ)與臨床的相互協(xié)作挖掘其潛在的發(fā)病機制。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。