局灶性癲癇患兒治療前后腸道菌群的變化及意義

龔帥正 仇君 吳麗文 譚李紅

（1.湖南省兒童醫院血液腫瘤科，湖南長沙 410007；2.湖南省兒童醫院《臨床小兒外科雜志》編輯部，湖南長沙 410007；3.湖南省兒童醫院神經內科，湖南長沙 410007）

癲癇是神經系統的常見疾病，據統計，全球有7 000多萬癲癇患者，發病率約為50/10萬人每年［1］，局灶性發作已成為兒童癲癇最常見的癲癇發作類型［2］，主要治療方式是口服抗癲癇藥物，且以奧卡西平治療居多。研究表明抗癲癇藥物治療兒童局灶性癲癇效果顯著［3］，但局灶性發作不僅可繼發其他嚴重的發作類型，如局灶繼發雙側強直-陣攣發作，而且仍有一部分患兒對抗癲癇藥物耐藥，發展為難治性癲癇，反復癲癇發作可導致認知缺陷，如記憶和學習障礙、永久性腦功能障礙及病死率增加等［4］，嚴重影響患兒的健康成長。近年來，研究發現腸道菌群可能通過腦-腸軸與大腦產生雙向聯系，包括迷走神經、下丘腦-垂體-腎上腺軸、免疫系統、神經遞質及炎癥因子等途徑，參與癲癇的發生發展［5］。因此本研究采用病例對照研究方法了解局灶性癲癇患兒與健康兒童腸道菌群的差異，以及了解癲癇患兒治療前后腸道菌群的變化，癥狀改善與腸道菌群的關系，希望為癲癇的發病機制及更好的替代治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2020年4～10月在湖南省兒童醫院神經內科就診的初診局灶性癲癇患兒，篩選符合納入標準的且以奧卡西平單藥治療的患兒為病例組，收集治療前和治療3個月后的糞便標本。病例組納入標準：（1）符合2017年國際抗癲癇聯盟的癲癇診斷標準［6］。（2）腦電圖和臨床表現支持癲癇局灶性發作。（3）頭顱MRI未見明顯異常。（4）入組年齡＞2歲，性別不限，于我院神經內科首次確診。（5）治療前3個月內癲癇發作頻率≥2次。（6）監護人知情同意。排除標準：（1）嚴重營養不良或過剩；（2）收集糞便標本2周前有嘔吐、腹瀉、腹痛、便血等消化系統疾病病史；（3）收集糞便標本2周前有使用抗生素及益生菌史；（4）合并孤獨癥譜系障礙疾病、代謝性腦病等癲癇以外的神經或精神疾病；（5）血氨基酸/尿有機酸代謝異常；（6）近2個月飲食習慣有明顯變化。治療3個月后排除標準：（1）治療期間未規律服用抗癲癇藥物；（2）治療期間有加用或替換其他抗癲癇藥物；（3）治療期間飲食習慣有明顯改變；（4）治療期間有居住地遷移史；（5）收集糞便標本2周前有嘔吐、腹瀉、腹痛、便血等消化系統疾病病史；（6）收集糞便標本2周前有使用抗生素及益生菌史。

另招募相同地區相同年齡段的健康兒童為對照組。納入標準：（1）入組年齡＞2歲，性別不限；（2）在我院兒童保健科體格檢查合格；（3）監護人知情同意。排除標準：（1）營養不良或過剩；（2）收集糞便標本2周前有嘔吐、腹瀉、腹痛、便血等消化系統疾病病史；（3）收集糞便標本2周前有使用抗生素及益生菌史；（4）既往有癲癇、孤獨癥譜系障礙疾病、代謝性腦病等神經或精神疾病；（5）近2個月飲食習慣有明顯變化。

本研究已通過我院倫理委員會審查（HCHLL-2020-53）。

1.2 糞便標本收集

使用常規糞便采集器收集患兒治療前的糞便標本，取糞便中段標本，每份標本重量應大于5 g，并于采集后半小時內保存于-80℃冰箱。患兒治療3個月后的糞便使用上海天昊生物科技有限公司提供的糞便采集套裝采集（此采集管收集的標本，在常溫下2周內不會改變糞便菌群），將糞便采集套裝及說明書郵寄給患兒家屬，由家屬采集大于5 g的糞便中段標本，保存于糞便采集管的保存液中。對照組的糞便標本收集同治療后組。收到標本后同樣保存于-80℃冰箱，之后再通過干冰運送到高通量測序服務公司。

1.3 16S rDNA測序

（1）提取糞便標本中細菌總DNA；（2）基因組DNA質量檢測；（3）在擴增引物下，對合格標本的檢測區域V4～V5區進行高保真聚合酶鏈式反應擴增；（4）通過高保真聚合酶鏈式反應對各樣本添加特異性標簽序列；（5）對已添加標簽的樣本文庫進行定量和混合；（6）通過Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進行質量檢測，再Illumina上機測序，后續對測序數據進行生物信息學分析。

1.4 生物信息學分析

計算菌群多樣性的指數：Shannon指數和Simpson指數是常用的反映α-多樣性指數。Shannon指數數值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數數值越小，說明群落多樣性越高。

Metastats分析：通過對組間樣本進行比較，在各分類水平上找出2組中差異有統計學意義的物種，以P＜0.05作為差異有統計學意義篩選閾值。

1.5 臨床療效評判

記錄患兒癲癇發作頻率、發作形式、持續時間等情況。根據患兒治療前3個月和治療后3個月之間癲癇發作頻率減少百分率進行療效判斷，其評定標準為：（1）完全控制：無癲癇發作；（2）有效：癲癇發作頻率減少≥50%；（3）無效：癲癇發作頻率減少＜50%或加重。總有效率=完全控制率+有效率［7］。

1.6 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行數據處理。正態分布計量資料用均數±標準差（±s）描述，組間比較采用兩樣本t檢驗；非正態分布計量資料用中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］描述，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗或Wilcoxon符號秩檢驗；計數資料用例數和百分率（%）描述，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的基本資料

本研究最初納入17例局灶性癲癇患兒，經治療3個月后隨訪發現治療無效1例，6例因拒接隨訪電話或拒絕收集隨訪標本剔除，由于治療無效病例太少，不能單獨進行數據分析，故不納入研究。最終本研究共納入10例治療有效（7例完全控制，3例癲癇發作頻率較前減少≥50%）的局灶性癲癇患兒為病例組，14例健康兒童納入對照組，2組兒童年齡、性別、體重指數差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 病例組和對照組一般資料比較

2.2 多樣性指數分析

治療前組和治療后組Shannon指數較對照組均升高（P＜0.05），治療前組Simpson指數較對照組減少（P＜0.05）。治療前組和治療后組Shannon指數、Simpson指數差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 治療前組、治療后組和對照組多樣性指數比較［M（P25，P75）］

2.3 Metastats分析：從門水平分析腸道菌群組成

門水平方面，治療前組、治療后組和對照組腸道菌群結構主要由擬桿菌門、厚壁菌門組成，見圖1。從各組菌群豐度值可看出，選取的菌群要求至少有1組菌群豐度＞1%，治療前組放線菌門豐度高于對照組和治療后組（P＜0.05），治療后組與對照組間擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門豐度差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 3組門水平上的腸道菌群差異 （±s）

表3 3組門水平上的腸道菌群差異 （±s）

注：P1代表治療前組vs對照組；P2代表治療前組vs治療后組；P3代表治療后組vs對照組。

菌門擬桿菌門厚壁菌門變形菌門放線菌門P1值P2值P3值0.873 0.586 0.897 0.940對照組0.550±0.024 0.411±0.020 0.033±0.007 0.003±0.001治療前組0.484±0.026 0.445±0.028 0.053±0.013 0.016±0.005治療后組0.557±0.035 0.389±0.035 0.035±0.006 0.003±0.001 0.072 0.335 0.220 0.005 0.099 0.215 0.199 0.003

2.4 Metastats分析：從屬水平分析腸道菌群組成

從屬水平上分析治療前組、治療后組和對照組之間的腸道差異菌群，見圖2和表4，選取的菌群要求至少有1組菌群豐度＞1%，結果顯示治療前組腸道菌群差異最大，治療前組埃希菌/志賀菌屬、鏈球菌屬、Romboutsia屬、柯林斯菌屬和巨單胞菌屬的豐度均高于對照組和治療后組（P＜0.05）。而對照組和治療后組間腸道菌群差異小，對照組副擬桿菌屬、顫桿菌克屬和巨單胞菌屬豐度高于治療后組（P＜0.05），治療后組的Anaerostipes屬豐度高于對照組（P＜0.05）。

表4 3組在屬水平上的腸道菌群豐度差異 （±s）

表4 3組在屬水平上的腸道菌群豐度差異 （±s）

注：P1代表治療前組vs對照組；P2代表治療前組vs治療后組；P3代表治療后組vs對照組。

菌屬擬桿菌屬糞桿菌屬普雷沃菌屬布勞特氏菌屬羅氏菌屬副擬桿菌屬別樣桿菌屬瘤胃球菌屬埃希菌/志賀菌屬顫桿菌克屬鏈球菌屬Romboutsia屬柯林斯菌屬巨單胞菌屬Anaerostipes屬P1值P2值P3值對照組0.421±0.047 0.131±0.013 0.088±0.049 0.032±0.005 0.036±0.011 0.011±0.005 0.022±0.010 0.016±0.005 0.002±0.001 0.004±0.002 0.002±0.001 0.002±0.001 0.001±0.001 0.000±0.000 0.017±0.005治療前組0.329±0.050 0.083±0.011 0.076±0.038 0.055±0.012 0.032±0.008 0.032±0.007 0.022±0.006 0.030±0.009 0.031±0.012 0.004±0.001 0.015±0.004 0.013±0.006 0.012±0.004 0.019±0.007 0.007±0.002治療后組0.353±0.070 0.121±0.015 0.124±0.056 0.017±0.005 0.020±0.005 0.031±0.004 0.027±0.008 0.017±0.004 0.001±0.001 0.013±0.002 0.002±0.001 0.002±0.001 0.002±0.001 0.003±0.001 0.003±0.000 0.451 0.585 0.626 0.060 0.190 0.012 0.681 0.837 0.891 0.011 0.842 0.815 0.177 0.008 0.001 0.197 0.007 0.886 0.065 0.761 0.025 0.990 0.197 0.002 0.770 0.001 0.023 0.003 0.003 0.086 0.762 0.059 0.482 0.005 0.228 0.858 0.627 0.213 0.002 0.015 0.001 0.034 0.005 0.028 0.009

3 討論

本研究經多樣性指數分析發現治療前組α-多樣性顯著高于對照組，而治療后組的多樣性較治療前組有下降趨勢，表明局灶性癲癇患兒在經治療有效后腸道菌群多樣性下降。Peng等［8］研究也發現耐藥性癲癇組菌群多樣性顯著高于藥物敏感性癲癇組和健康對照組，同時后者兩組間多樣性接近，本研究與該結果［8］基本一致。另有研究也證明了癲癇治療前后腸道菌群多樣性存在變化，Zhang等［9］通過生酮飲食治療20例難治性癲癇患兒，6個月后患兒的腸道菌群多樣性降低，且觀察到有10例患兒癲癇發作得到有效控制。這說明腸道菌群多樣性增加可能在癲癇中起到有害作用。另一方面，也有研究認為腸道菌群多樣性增高可能對神經發育不利，Carlson等［10］研究發現，腸道菌群多樣性與認知水平有關，α-多樣性越高認知表現越差。因此，降低局灶性癲癇患兒中的腸道菌群α-多樣性可能有利于減少癲癇發作頻率，本研究治療后組菌群多樣性較治療前組下降，但差異無統計學意義，可能是癲癇治療時間短，從而菌群改變少有關。

本研究發現治療前組放線菌門、埃希菌/志賀菌屬、鏈球菌屬、柯林斯菌屬和巨單胞菌屬豐度顯著高于對照組，且經治療后其豐度顯著降低。放線菌門包括紅蝽菌目、紅蝽菌科和柯林斯菌屬，文獻報道［11］大部分紅蝽菌綱屬于厭氧菌，在人體腸道內有致病性，而柯林斯菌屬是其優勢菌群。柯林斯菌屬能誘導白細胞介素（interleukin，IL）-17細胞因子的表達［12］，輔助性T細胞17主要產生IL-17A、IL-17F和IL-22，而癲癇發作間期IL-17A水平與癲癇發作頻率和嚴重程度呈正相關［13］。埃希菌/志賀菌屬被報道其豐度與IL-1β、CXCL2和NLRP3炎性小體的水平呈正相關［14］，其中NLRP3炎性小體能促進炎性細胞因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌［15-16］，IL-1β也能增加神經元興奮性，參與癲癇發作［17-19］。鏈球菌是一種常見的病原菌，其生長的增加會提高IL-6和腫瘤壞死因子α的水平［20］。腫瘤壞死因子α被報道能促進Ca2+大量內流，導致神經興奮性增強［21］。此外，IL-6也可能與癲癇發作有關［22］。因此，柯林斯菌屬、埃希菌/志賀菌屬、鏈球菌屬在局灶性癲癇患兒中可能通過神經炎癥參與癲癇發生。

本研究發現，治療后組和對照組糞桿菌屬和普雷沃菌屬豐度顯著高于治療前組，對照組糞桿菌屬豐度顯著高于治療前組。普雷沃菌屬、糞桿菌屬能產生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）［23-24］。SCFAs是調節小膠質細胞成熟、形態和功能的關鍵分子，小膠質細胞作為神經組織內重要的免疫細胞，是中樞神經系統穩態的參與者，在應激或病理狀態下，小膠質細胞被活化，從而分泌大量炎癥因子，如IL-1、IL-8、腫瘤壞死因子α等，引起神經元免疫性損傷，參與癲癇的發生機制［25-29］。另有研究表明［30］在大鼠近端結腸腔內注射生理濃度的SCFAs，可刺激腸嗜鉻細胞釋放5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），5-HT作為一種神經遞質，存在不同的受體類型，其中5-HT 7型受體激活后，可抑制癲癇發作［31］。所以擬桿菌屬、普雷沃菌屬可能通過SCFAs調控免疫炎癥和神經遞質水平，在局灶性癲癇中起到保護作用。

局灶性癲癇患兒與健康兒童的腸道菌群存在顯著差異，患兒經奧卡西平抗癲癇治療后臨床癥狀改善，腸道菌群也發生改變。奧卡西平抗癲癇的機制可能是通過阻斷電壓依賴性鈉通道降低神經細胞膜興奮性和突觸興奮傳遞能力，抑制神經元反復放電來實現的，但其作用于腸道菌群的機制尚不清楚，筆者認為，奧卡西平可能通過腦-腸軸的雙向聯系來調節腸道菌群。

腸道菌群與癲癇的緊密聯系，使得糞便微生物群移植（fecal microbiota transplantation，FMT）可能作為治療癲癇的新方法，曾有1例伴有17年癲癇發作病史的克羅恩病患者，癲癇發作頻率約120次/年，經過FMT治療后，該患者在無抗癲癇藥物治療下近20個月無癲癇發作［32］。此外，Vendrik等［33］認為FMT對于治療孤獨癥譜系障礙、多發性硬化、帕金森病及癲癇等神經系統疾病十分有前景。然而，目前可用的臨床證據很少，需要大型前瞻性雙盲隨機對照試驗來進一步證明FMT在癲癇治療中的作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突關系。