持續激活β連環蛋白對老年和成年小鼠骨量影響的研究

周曉英 宗兆文 鮑全偉

1.中國人民解放軍陸軍軍醫大學高原軍事醫學系高原生理學與病理學教研室，重慶 400038 2.中國人民解放軍陸軍軍醫大學陸軍衛勤基地戰救技能培訓教研室，重慶 400038 3.中國人民解放軍陸軍軍醫大學第二附屬醫院急診科，重慶 400037

骨量下降、骨骼退行性變、并發骨折導致老年人死亡風險增加[1-2]。Wnt/β-catenin信號通路參與體內多種細胞生理的調節，在成骨細胞的成熟、分化，骨質量調節，關節炎發生發展過程中均起到不可替代作用[3-5]。研究顯示眾多抗骨質疏松藥物調節骨量直接或間接通過該信號通路來實現，針對該信號通路的藥物用于骨質疏松的治療也取得了一定療效。但目前尚未有報道激活該信號通路后老年小鼠與成年小鼠骨量增加的特點，本實驗擬將在成年與老年小鼠中激活該通路并對骨量增加的作用進行對比探討。

1 材料和方法

1.1 基因小鼠的激活

選取4月齡與18月齡基因型為3.2Cre；Catnb+/lox(exon3)小鼠各6只作為成年組與老年組，并選取相應年齡段同窩WT小鼠各6只作為對照組。注射他莫昔芬，激活小鼠成骨細胞內β-catenin。藥物注射方式：腹腔注射；濃度為：TM75 mg/kg；頻次：2次/周；注射時長：4周[6-8]。激活小鼠表示以CA-β-catenin命名。

1.2 CT圖像采集

采用小動物CT成像系統對小鼠脛骨標本進行掃描，并分別計算骨體積(BV，mm3)占組織總體積(TV，mm3)的百分比(BV/TV，%)，骨小梁數目(Tb.N)，骨小梁分離度(Tb.Sp)，骨小粱厚度(Tb.Th)[9]。

1.3 HE染色

將標本制作4 μm石蠟組織切片。染色具體方法為：①脫蠟；②切片上滴加蘇木精染液，約50 μL，染色時間為2 min；③滴加伊紅染色液，約50 μL，1 min。

1.4 免疫組化染色

染色具體流程為：①消除過氧化物酶：滴加專用復合液，每個標本約為50 μL，時間不小于5 min；②抗原修復：清洗后滴加抗原修復液，每個標本約為50 μL，時間不少于30 min；③血清封閉：清洗后滴加血清封閉液，每個標本約為50 μL，時間20 min，不洗；④每個標本滴加TNAP一抗，平均每個標本約50 μL，然后于濕盒內反應，4 ℃時間大于16個小時；⑤將濕盒拿出置于37 ℃孵箱內復溫，時間不少于60 min；⑥滴加相對應的二抗，每個標本約50 μL，37 ℃，1 h；⑦SABC液，37 ℃，30 min，PBS清洗；⑧顯微鏡下顯色觀察。

1.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色

染色步驟：①萘酚AS-BI磷酸鹽溶液100 μL，37 ℃、45 min；②基礎孵育液添加5 %副品紅及4 %亞硝酸鈉，孵育2～3 min；③封片觀察[8]。

1.6 小鼠血清學生化檢測

收集小鼠血清，血清采集方法為：①摘除小鼠眼球，擠壓小鼠腹部用1.5 mL EP管收集小鼠血液；②將收集樣本靜置；③等待樣本凝固后離心機上1 500 r/min，10 min；④另取EP管，將離心后的上清收集備用。運用小鼠骨特堿性磷酸酶ELISA試劑盒以及小鼠Ⅰ型膠原N端肽ELISA試劑盒檢測骨形成及骨吸收指標的血清含量[8]。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 成年與老年組中CA-β-catenin小鼠相比于野生小鼠骨量均增多

實驗發現各年齡段中CA-β-catenin小鼠的骨量均多于同組的野生型小鼠(圖1)。HE染色結果，提示成年與老年組中CA-β-catenin小鼠脛骨干骺端骨髓腔內骨小梁均較野生型增加(圖1a～d)；將小鼠脛骨干骺端行CT二維掃描，并計算骨量，結果發現不論成年還是老年組中CA-β-catenin小鼠干骺端骨小梁數目(Tb.N)，骨組織體積比(BV/TV，%)，骨小粱厚度(Tb.Th)均較WT小鼠增多(P<0.01)，以上結果均提示持續激活β連環蛋白后小鼠骨量會增加。骨量的多少通常由成骨與破骨的平衡所決定，非組織特異性的堿性磷酸酶(non-tissue specific alkaline phosphatase，TNAP)，可用來反映成骨細胞活性，針對TNAP免疫組化染色結果提示各年齡段中CA-β-catenin小鼠TNAP陽性成骨細胞數量均多于同窩WT 小鼠(圖2a～d,i)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)結果提示各年齡段中CA-β-catenin小鼠破骨細胞數量均少于同窩WT 小鼠(圖2e～h,j)。ELISA實驗結果提示各年齡段中CA-β-catenin小鼠骨形成指標ALP均高于同窩WT 小鼠(圖2k)，而骨吸收指標CTCX1均低于同窩WT 小鼠(圖2 l)。

注：a～d：各組小鼠HE染色結果；e～h：各組小鼠CT掃描二維圖片；i～l：CT數據分析統計結果。** P<0.01，放大倍數：40×。圖1 各組小鼠骨量變化Fig.1 Changes of bone mass in mice in each group

2.2 不同年齡組中CA-β-catenin小鼠骨量增加有差異

雖然在成年組和老年組持續激活β-catenin后其骨量都比WT小鼠有增加，但老年CA-β-catenin小鼠與成年CA-β-catenin小鼠相比，骨量增加特點卻不盡相同。持續激活β-catenin后，成年CA-β-catenin小鼠總骨量明顯多于老年CA-β-catenin小鼠(圖3a～c)，但將成年及老年組CA-β-catenin小鼠小鼠注射激活β-catenin藥物前后對照可發現老年組CA-β-catenin小鼠骨量增加幅度ΔTb.Th、ΔBV/TV、ΔTb.N比成年組更大(圖3 d～h)，分析破骨細胞染色結果可發現老年組CA-β-catenin小鼠破骨細胞數量多于成年組CA-β-catenin小鼠(圖3i)。

注：a～c：成年與老年組中CA-β-catenin小鼠骨量對比；d～g：成年與老年組中CA-β-catenin小鼠激活β-catenin前后骨量變化對比；i：成年與老年組中CA-β-catenin小鼠破骨細胞數量對比。*P<0.05。圖3 CA-β-catenin小鼠骨量變化分析Fig.3 Analysis of bone mass changes in CA-β-catenin mice

3 討論

近年來，骨質疏松有年輕化趨勢，各個年齡階段均有可能罹患骨質疏松，整體形式嚴峻。目前針對骨質疏松的藥物治療方案有抗骨吸收及促進骨形成。然而對不同年齡段骨質疏松治療方案選擇尚缺乏有力基礎研究支持。本研究比較了成年與老年小鼠中激活Wnt/β-catenin信號通路后對骨量變化的影響。

Wnt/β-catenin被證實與骨發育及骨量相關[6-8]，當Wnt/β-catenin信號通路激活時，β-catenin作為信號分子可進入細胞核，促進成骨細胞分化相關的基因表達如：ALP、OSX等[10-11]。以往的研究證實3.2kbCol 1 Cre表達于成骨細胞內，可特異性敲出錨定的基因[6-7]。在本研究中，運用3.2Cre；Catnb+/lox(exon3)小鼠可于成骨細胞中特異性激活β-catenin。

本研究發現激活β-catenin后成年及老年小鼠TNAP陽性細胞數量均上升，血清中ALP活性均上升。Wnt/β-catenin信號通路除了可以調節成骨細胞生理活動，還可以通過成骨細胞分泌OPN調節破骨細胞活性[12-14]。研究發現激活β-catenin后成年及老年小鼠TRAP陽性細胞數量明顯下降，血清中CTCX1活性明顯下降，這些骨形成指標上升、骨吸收指標下降，共同導致激活β-catenin后小鼠骨量增加。雖然持續激活β-catenin使小鼠骨量增加，但也發現在持續激活β-catenin前后各組小鼠自身骨量變化對比發現老年組CA-β-catenin小鼠骨量變化幅度較成年CA-β-catenin小鼠大。進一步分析發現老年組CA-β-catenin小鼠總骨量低于成年CA-β-catenin小鼠，這可能與老年組CA-β-catenin小鼠破骨細胞數量多于成年組CA-β-catenin小鼠有關，因年齡導致老年組CA-β-catenin小鼠破骨細胞活性強于成年組CA-β-catenin小鼠，導致骨吸收強于成年組CA-β-catenin小鼠。以上研究提示在老年性骨質疏松治療時需同時促進骨形成與抑制骨吸收才能達到最佳效果。

現臨床治療骨質疏松主要是運用抗骨吸收藥物，該類藥物只能抑制骨不繼續吸收，無法促進新骨形成。現有通過批準的骨合成代謝藥物只有重組甲狀旁腺激素(rPTH，特立帕肽)，然而這種藥物因為延長治療時間可能會增加罹患腫瘤的風險，因此在使用2年后必須停用，這限制了其長期運用[15]。Wnt/β-catenin信號通路相關藥物可同時促進骨形成及抑制骨吸收，貌似給了我們一條不錯的前景，但通過我們研究發現，對于老年小鼠增強Wnt/β-catenin信號后成骨細胞及骨形成指標上升，破骨細胞及骨吸收指標下降，但相較于成年小鼠其破骨細胞數量及骨吸收指標仍然較高，這對于臨床治療有著重要指導意義。

通過我們的研究發現針對老年性骨質疏松運用Wnt/β-catenin信號通路相關藥物可以取得較好效果，但仍需關注老年自身高骨吸收。