H型血管在骨質疏松癥中的研究進展

張志秀 劉靜 曾佩蕓 錢子冰 張琦

1.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨吸收速度大于骨形成導致退變的疾病，具有骨微結構退化、骨密度(BMD)低的特點，常伴有骨折、疼痛和身體限制，給人類帶來巨大的痛苦[1-3]。據估計，全世界有2億女性患有此病，每年造成超過890萬例骨折，50歲以上的中國人每年導致約68.7萬人髖部骨折[3]。雖然在針對該病的機制方面取得了進展，但目前的治療效果仍然不太理想[1]。有研究[4]報道在小鼠骨骼系統中發現新型毛細血管亞型，其具有特殊的形態、功能和分子特性。這些血管具有特定的結構，可參與骨內血管的生長，維持血管周圍骨祖細胞的數量，并結合血管生成與骨生成[5]。研究發現老年動物骨中血管和骨祖細胞的數量明顯減少，這在藥理學上是可逆的，可以恢復骨量。因此，本文就H型血管在骨質疏松癥中的研究進展做一綜述，以進一步為骨質疏松癥的進展提供新的研究目標。

1 H型血管的結構及功能

血管是由多種類型的細胞組成的，其中內皮細胞(endothelial cells，ECs) 在血管形成、血管生成和止血過程中起著關鍵的調控作用[6]。骨血管內排列著分化的血管內皮細胞，具有特殊的形態、功能和分子特性。Kusumbe等[4]在小鼠生長板附近的小梁骨和皮質骨中以及在骨膜和骨內膜表面發現了一種特殊的血管亞型，根據內皮細胞表面標志物的差異，分為H型血管和L型血管。H型血管中血小板內皮細胞粘附分子-1(CD31)和內粘蛋白(endomucin，EMCN)高表達，L型血管中CD31和EMCN低表達。H型血管位于干骺端生長板附近，同時位于骨干的骨膜和內層及關節軟骨下，周圍聚集著著大量的 Osterix+骨祖細胞，通過產生特定因子進而刺激骨髓中骨祖細胞增殖和分化，積極引導骨形成。研究發現H型血管和骨祖細胞的數量與年齡呈現負相關，隨年齡增加而減少，為老年性骨質疏松癥的診治提供了新的措施[4,6-8]。隨后王亮等[9]研究中，他們通過收集股骨近端轉子間骨折并行近端髓內釘固定術后患者的骨標本，證實人骨組織中也存在這種血管。后來，Gao等[10]從髖關節置換術患者的股骨頭中分離血管內皮細胞，使用免疫熒光染色檢測血管內皮細胞CD31和EMCN的定位，一周左右在顯微鏡下觀察細胞形態，發現融合后細胞形成單層，呈束狀排列，輪生狀，生長呈貼壁抑制，細胞多呈短梭形、多角形和鵝卵石樣形態特征，證實在人股骨頭內存在H亞型血管內皮細胞(HSVECs)。經對照組、骨質減少組和骨質疏松組的比較顯示，H型血管與骨量減少的關系緊密，認為人類H型血管的密度是骨量減少的早期標記，可通過生成H型血管來增加骨量[11-12]。

2 參與H型血管生成與成骨的細胞因子

2.1 破骨細胞前體細胞分泌的血小板源性生長因子(PDGF-BB)

PDGF- BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)是PDGF家族中參與趨化和有絲分裂，在促進各種間充質細胞遷移、增殖和分化以促進血管生成和成骨過程中起關鍵作用的因子[13-15]。Xie等[16]在OVX(去卵巢骨質疏松小鼠模型)小鼠體內發現CD31hiEmcnhi血管減少，而破骨細胞前體細胞分泌的PDGF-BB可以誘導H型血管(CD31hiEmcnhi)血管生成，刺激骨形成，他們認為破骨細胞前體細胞是骨髓和外周血中PDGF-BB的主要來源,同時敲除組織蛋白酶K(Ctsk)或注射其抑制劑可有效增加PDGF-BB的水平，Ctsk抑制劑還可增加OVX骨質疏松小鼠的血管生成和骨生成[16-17]。研究發現蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2可誘導破骨細胞前體細胞向破骨細胞的轉化，實驗人員給3個月大的OVX小鼠體內注射SHP-2 抑制劑(NSC-87877)，發現NSC-87877可誘導骨質疏松小鼠骨髓中CD31hiEmcnhi血管和破骨細胞前體細胞的數量增加，PDGF-BB水平升高。體外實驗也表明，NSC-87877可防止破骨細胞前體細胞融合，增加PDGF-BB的產生，增強破骨細胞前體細胞促血管生成能力[18]。Jie等[19]通過給OVX小鼠體內灌Harmine乳劑，2個月后取骨標本進行μCT、HE、免疫組化和免疫熒光分析，評價骨量、成骨和破骨活性以及H型血管數量，發現去卵巢小鼠經Harmine乳劑處理后，骨髓中PDGF-BB水平升高，骨中H型血管明顯增多，認為Harmine乳劑可能通過抑制破骨細胞形成和促進破骨細胞前體細胞源性PDGF-BB的分泌來促進血管生成。后期Shangguan等[20]發現地塞米松可以通過抑制PDGF-BB下游的PDGFFRβ/FAK信號通路誘導H血管發育不良，增加骨質疏松的易感性。

2.2 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

VEGF(尤其是VEGF-A)作為一種趨化分子，其分泌是成骨和血管生成偶聯所必需的,通過將內皮細胞吸引到骨組織中，從而調控成骨細胞和破骨細胞的分化與功能，參與骨重建[21-23]。有研究利用特異性缺失VEGFA轉基因小鼠的成骨細胞，在通過膜內成骨發生修復的區域，血管生成和成骨耦聯需要最佳水平的VEGF，證明了VEGF在炎癥階段可趨化巨噬細胞募集和血管生成反應，猜測其可能在這一過程中起旁分泌的功能。此外，另有研究[24-25]顯示肥大的軟骨細胞以及成骨細胞來源的VEGF刺激破骨細胞和血管的募集，并在骨膜軟骨內成骨階段促進修復部位的軟骨吸收。PDGF-BB可以增強內皮祖細胞中的VEGF信號，以保護內皮細胞管的形成[17]。但是，VEGF調控H型血管生成與骨生成具體機制還有待研究，同時骨質疏松治療可能會影響循環中VEGF的水平，因此，需要進一步研究以確定VEGF是否在骨質疏松中起因果作用。

2.3 缺氧誘導因子 HIF-1α(hypoxia-induced factor 1α)

HIF-1α是一種異源二聚體轉錄因子，介導細胞對氧變化的反應，并調控生理性以及病理性新生血管的生成。內皮細胞中缺氧信號導致H型血管數量增加，從而促進軟骨內血管生成和成骨過程[14,26]。Kusumbe等[4]在實驗中發現H型和L型兩種類型的骨血管內皮細胞，這兩種類型血管內皮細胞在HIF-1α和表面標志物的表達水平上存在差異，HIF-1α在H型血管內皮細胞中明顯表達，定位于軟骨-骨交界處附近，還表現出CD31hiEmcnhi的強烈表達，而L型內皮細胞定位于骨干的竇狀血管，以CD31和EMCN低表達為特征。同時發現幼鼠體內HIF-1α在H型內皮細胞高表達，且表達水平隨著幼鼠年齡的增長而降低，證明年齡依賴性的骨量丟失與H型內皮細胞的減少有關。ECs特異性分泌的HIF-1α的缺失導致骨祖細胞顯著減少，并伴隨著骨小梁形成的減少[27]。Wang等[11]通過對去卵巢小鼠(OVX)腹腔注射去鐵胺(DFO)4周后發現H型血管和骨祖細胞的數量增加，DFO可抑制脯氨酰-4-羥化酶，從而增強HIF-1α的活性和穩定性，誘導血管生成信號上調，促進血管生成和增加去卵巢小鼠H型血管，導致骨量顯著增加，有潛力作為理想靶點來治療骨質疏松，誘導骨生成。

3 參與H型血管生成與成骨的其他因素

3.1 Notch信號通路調控H型血管的形成

Noch信號通路在胚胎發育、細胞增殖、分化和動態平衡等過程中起著重要的調節作用。自從Dexter和Morgan發現了帶缺口翅膀的突變果蠅以來，已經有大量的研究和動物模型闡明了Notch信號的生理和病理作用。Notch受體及其配體是跨膜蛋白，通過細胞與細胞間的物理作用啟動其信號級聯反應。人類有四種Notch受體(Notch1～4)和五種不同的Notch配體(JAG1、JAG2、DLL1、DLL3和DLL4)[28]。Notch信號通路參與了骨骼細胞的增殖、分化和凋亡，調節骨骼發育和骨重塑，并且已經在轉基因動物模型和體外進行的研究中證實，對骨骼細胞的活動和骨骼發育至關重要[14,29]。Ramasamy等[30]對小鼠體內Notch信號進行遺傳干擾后，發現小鼠不僅H型血管的形態與生長受到損害，還會導致成骨障礙、長骨變短、軟骨細胞突變、骨小梁缺失和骨量下降。給予重組Noggin(一種分泌型骨形態發生蛋白拮抗劑)可恢復骨生長和礦化、軟骨細胞成熟、小梁形成以及內皮細胞特異性Notch信號途徑突變體中的骨祖細胞數量，證實內皮細胞Notch信號活性可促進骨內H型血管形成和成骨。

3.2 低強度脈沖超聲促進骨H型血管的形成

1983年，Xavier和Duarte首次使用低強度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)加速人體骨折修復過程[31]。此后，人們對LIPUS的效果進行了大量的研究，最近，LIPUS作為骨折愈合的一種無創輔助治療方式已在臨床試驗中報道，證據表明，LIPUS在治療骨折和延遲骨不愈合、修復肌腱和韌帶以及改善脊柱融合方面是有效的。此外，LIPUS對四肢骨折有很強的療效，可以增加軟骨細胞和成骨細胞的產量，加速骨痂的形成[32]。其次，研究發現LIPUS可以加速脊柱融合，使H型血管增多。對40只雄性SD大鼠進行單節段單側脊柱后關節融合術，隨機分為LIPUS組和對照組，各20只，LIPUS組術后第三天開始使用LIPUS，術后兩周發現兩組中均出現CD31hi微血管，血管稀疏，LIPUS組高于對照組，術后4周，LIPUS組和對照組的平均血管密度分別為(3.22±0.56)%和(1.81±0.60)%(P<0.01)，LIPUS組與對照組相比，Emcnhi微血管明顯增多，證實LIPUS能顯著增加脊柱融合過程中的成骨細胞數量，這一過程與H型微血管生成增加有關[33]。Wu等[32]建立創傷性椎體骨折大鼠模型，術后采用LIPUS治療，術后4周采用X線攝片、計算機斷層掃描、三維重建等方法評價骨愈合情況，組織學分析評價成骨過程及與H型微血管的關系。LIPUS治療組與對照組相比，小梁網重塑良好，骨折處形成豐富的軟骨細胞、骨髓腔、骨小梁和H型微血管，證實低強度脈沖超聲可增加創傷性椎體骨折模型中軟骨、成骨細胞以及H型微血管的生成，促進創傷性椎體骨折愈合。

3.3 MiRNAs調控血管生成與成骨

MiRNAs是一種進化上保守的內源性非編碼小RNA片段，長度為20～22個堿基對，參與真核基因的轉錄后調控。研究發現，單個miRNA可以靶向調控多個基因，因此基于miRNA的基因治療是一種發展迅速的疾病治療策略，在治療骨質疏松癥方面有很大的潛力[34]。此外，Yang等[35]發現miR-497～195群在CD31hiEmcnhi內皮細胞中豐富度高，并隨著年齡的增長呈負相關，內皮細胞miR-497～195群缺失的小鼠CD31hiEmcnhi血管較少，骨量較低。相反，在小鼠內皮細胞中過表達miR-497～195群可以減輕與年齡相關的CD31hi血管減少和骨量丟失。MIR-497～195群分別通過靶向F-box和WD-40結構域蛋白(Fbxw7)和具有跨膜結構域的脯氨酰4-羥化酶(P4HTM)來維持內皮Notch活性和HIF-1a的穩定性，研究表明miR-497～195群可以調控血管生成和成骨，可能成為治療老年性骨質疏松癥的新措施。

3.4 E型內皮細胞

近年來，Langen等[36]報道了一種強烈支持成骨細胞系的特殊內皮細胞亞型，其存在于胚胎以及出生后早期長骨，稱為E型，E型內皮細胞可分化為H型內皮細胞，與H型毛細血管相比，E型血管與Osterix+骨祖細胞的相關性更強，細胞基質信號通過指定發育成骨過程中的骨內皮細胞來調節骨生成。

3.5 鋅指轉錄因子ZEB1

鋅指E盒結合同源框1(ZEB1)是一種鋅指轉錄因子，可觸發上皮-間充質轉化(EMT)程序，對正常發育和病理狀態至關重要[37]。鋅指轉錄因子ZEB1在人和小鼠骨內的H型血管內皮細胞中強烈表達，小鼠內皮細胞特異性缺失ZEB1會損害骨內CD31hi血管的形成，導致成骨減少。從機制上講，ZEB1缺失減少了DLL4和Notch1啟動子上的組蛋白乙酰化，從而抑制了控制骨血管生成和成骨的Notch信號。ZEB1在骨質疏松癥小鼠和人類骨骼內皮細胞中的表達下降，給骨質疏松小鼠注射ZEB1包裝的脂質體可以恢復受損的骨骼內皮Notch活性，進而促進血管生成依賴性的成骨，改善骨量丟失，藥物逆轉低ZEB1/Notch信號可能通過促進血管生成依賴性骨形成對骨質疏松患者發揮治療作用[38]。

4 小結與展望

骨是一種高度血管化的結締組織，骨骼血管在骨發育、再生和重建過程中起著重要作用[39-40]。在小鼠和人體骨骼系統中發現H型血管，顯示H型血管生成與骨生成存在耦合，認為H型血管的密度是骨量減少的早期標記，可作為誘導H型血管來改善骨質量的新措施[4,11,30]。目前骨質疏松癥的治療主要集中于靶向抑制破骨細胞骨吸收或合成代謝療法刺激成骨細胞骨形成，由于它們的生物利用度有限和其他有害的影響，治療效果不是很理想。隨著我國人口逐漸進入老齡化，骨質疏松癥的發病率也在逐漸升高，成為公共衛生一大難題。相信在未來，改善H型血管在骨量丟失方面的研究將會為骨質疏松癥的診治提供一條很有前途的研究方向。