HER2陽性乳腺癌ERBB3基因E928G點突變功能的初步研究

韋光楠，廖寧，陳博

(1.華南理工大學醫學院，廣州 510006； 2.廣東省人民醫院 廣東省醫學科學院乳腺外科，廣州 510080)

根據全球流行病學調查顯示，乳腺癌在女性中的發病率呈逐年上升趨勢[1]。其中人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor,HER)2過表達型發病率為15%～20%，因易發生腦轉移，患者預后較差。抗HER2靶向藥物治療的效果較好，但腫瘤耐藥的發生大大縮短了患者的生存期[2-3]。HER3/ERBB3作為HER家族中的一員，能與HER2形成異源二聚體，該二聚體在HER家族異源二聚體中活性最強。HER2/HER3異源二聚體的形成能激活下游信號通路，促進腫瘤細胞增殖、分化[4-5]。當ERBB3形成異二聚體且被磷酸化后，胞內暴露出的6個磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)亞基結合位點能夠募集PI3K至調節亞基位點，進而激活下游PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)信號通路，導致腫瘤耐藥的發生[6]。因此，ERBB3基因作為乳腺癌治療的另一個可行靶點越來越受到重視[7]。CLEOPATRA臨床研究發現，ERBB3過表達與患者的不良預后相關，但進一步分析發現，ERBB3并不能預測藥物治療對患者是否獲益[8-9]。在基礎研究中發現ERBB3錯義突變能增強ERBB2/ERBB3異源二聚體的活性，從而促進腫瘤生長，導致抗HER2治療耐藥的發生[10]。目前對于ERBB3基因在乳腺癌中的研究結果尚不統一，對乳腺癌的治療效果仍不明確[11-12]。因此，本研究通過體外細胞實驗驗證ERBB3基因突變可能對乳腺癌細胞造成的影響，為后續進一步研究ERBB3基因在乳腺癌細胞中的作用提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2017年6月至2019年5月就診于廣東省人民醫院經病理確診為乳腺癌的患者384例。免疫組織化學雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體任一項陽性定義為激素受體(hormone receptor,HR)陽性，其中HR-/HER2-患者50例，HR-/HER2+患者43例，HR+/HER2-患者227例，HR+/HER2+患者64例。本研究獲得廣東省人民醫院倫理委員會批準，患者均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑 Nextseq500測序平臺(美國Illumina公司)，高速離心機Z230MR(德國HERMLE公司)，Bio-Rad T100聚合酶鏈反應儀、中型垂直電泳系統、B107蛋白印跡成像分析系統均購自美國Bio-Rad公司，細胞培養二氧化碳孵育箱和超凈工作臺(美國Thermo公司)，DKZ-1恒溫水浴箱(上海一恒科技有限公司)，JY96-IIN超聲裂解細胞儀(上海滬析公司)。核酸提取及純化試劑盒、基因測序用文庫試劑盒均購自美國Agilent公司，杜爾貝科改良伊格爾高糖培養基、澳洲胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(批號：P0010S)、3-磷酸甘油醛脫氫酶內參抗體(批號：AF1186)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置試劑盒(批號：P0012A)均購自上海碧云天公司，磷酸化ERBB3(Tyr1289)抗體(美國Affinity公司生產，批號：DF7597)，磷酸化Akt(Ser473)抗體(批號：4060T)、Akt抗體(批號：4691S)均購自美國Cell Signaling Technology公司，ECL熒光檢測試劑(北京索萊寶公司生產，批號：PE0010)。人HER2陽性乳腺癌細胞株BT474-V1、SKBR3-V1，ERBB3基因正常表達的人HER2陽性乳腺癌細胞株BT474-C1、SKBR3-C1，ERBB3基因E928G突變的人HER2陽性乳腺癌細胞株BT474-M1、SKBR3-M1均由中山大學腫瘤醫院實驗室提供。

1.2.2基因組DNA提取 石蠟包埋組織樣本在提取核酸前進行組織脫蠟，新鮮組織樣本無需進行此步驟。新鮮組織標本研磨成小顆粒，石蠟包埋組織標本脫蠟后研磨，加入細胞裂解液，充分混勻后加入蛋白酶K，水浴加熱至完全溶解，加入核糖核酸酶A，水浴1 h迅速降溫，加入蛋白沉淀液離心，取上清液加入異丙醇，離心，棄上清液，加入70%乙醇沖洗DNA沉淀，離心棄去上清液，加入DNA溶解液水浴溶解DNA。樣本質量要求核酸總量>50 ng為合格品，DNA純度A260/A280為1.7～2.1。

1.2.3上機測序及數據分析 引物設置為寡核苷酸，模板為文庫片段進行DNA的復制，復制完成后將文庫片段洗脫，采用邊合成邊測序，在Read1完成后，解鏈并洗掉測序中合成的部分，加入Index引物，繼續進行復制，讀出接頭中Index序列，從而得出每個位點的DNA所屬文庫。本研究測序范圍覆蓋520個癌癥相關基因的基因組進行分析，對于目的基因ERBB3的檢測包括拷貝數變異、基因融合、單核苷酸變異、插入或缺失等。

1.2.4Western blot檢測磷酸化Akt水平 采用胰酶分別消化細胞株BT474-V1、SKBR3-V1、BT474-C1、SKBR3-C1、BT474-M1、SKBR3-M1，在培養皿中加入培養基，移液槍吹打成細胞懸液后轉移至EP管中，2 500 r/min離心5 min，棄去上清液。磷酸鹽緩沖溶液吹打洗滌細胞，繼續離心，再重復磷酸鹽緩沖溶液洗滌1次。在每管細胞中加入細胞裂解液置于冰上裂解5 min，再將每管置于超聲裂解細胞儀繼續裂解。取上清液分裝于0.5 ml離心管。本實驗采用BCA法測蛋白濃度，具體操作流程嚴格按照試劑盒流程執行并繪制標準曲線圖，按照標準曲線計算出待測蛋白濃度。采用凝膠試劑盒操作說明進行凝膠的配置。待測樣品中加入Loading buffer混勻后，金屬浴100 ℃ 5 min。每孔上樣量12 μl后連接電源正負極進行電泳，初始先將電流設置為80 V電泳20 min后，增大電壓至120 V繼續電泳，總時長為2.5 h。電泳結束后開始電轉膜，調整電流至250 mA，電壓100～120 V，轉膜時間為4 h。轉膜結束，加入封閉液室溫封閉1 h。一抗按照說明書稀釋后，搖床上4 ℃孵育過夜。一抗孵育結束后，在室溫下Tris-Hcl緩沖液洗膜3次，再加入與一抗相應的二抗室溫孵育1 h。孵育結束后，繼續用Tris-Hcl緩沖液洗膜3次。ECL工作液處理后，置于蛋白印跡ECL-過氧化物酶成像分析系統進行掃描拍照。

1.3統計學方法 采用PROVEAN、SIFT及Poly-Phen-2 HumVar生物信息學軟件預測點突變對蛋白質改變產生的危害性。PROVEAN軟件評分為-14～-2.5定義為有害突變，-2.5～14定義為良性改變；SIFT軟件評分>0.05定義為中性，<0.05定義為有害突變；Poly-Phen-2 HumVar軟件評分為0～0.446定義為中性，0.910～1.00定義為可能有害[13-14]。

2 結 果

2.1HER家族變異分布情況 384例患者中133例檢出HER家族變異(包括表皮生長因子受體1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)。表皮生長因子受體1變異頻率為1.3%(5/384)；ERBB2變異頻率最高，為28.9%(111/384)，其中ERBB2擴增103例，ERBB2突變14例，同一患者的ERBB2基因可同時存在多種變異類型；ERBB3變異頻率為3.4%(13/384)；ERBB4變異頻率為1.0%(4/384)。

2.2ERBB3基因變異患者的一般情況 13例ERBB3基因患者年齡22～80歲，中位年齡54歲，年齡≥50歲8例，年齡<50歲5例；月經狀態：絕經前6例，絕經后7例；病理類型：浸潤性導管癌11例，浸潤性小葉癌1例，浸潤性混合型癌1例；組織學分級：Ⅰ級2例，Ⅱ級5例，Ⅲ級6例；腫瘤大小：T17例，T25例，T31例；淋巴結轉移狀態：N010例，N11例，N21例，N31例；臨床分期： Ⅰ A 5例， Ⅱ A 6例，ⅢA 1例，ⅢC 1例；ER狀態：ER+10例，ER-3例；HER2狀態：HER2+3例，HER2-10例；HR/HER2狀態：HR+/HER2-7例，HR+/HER2+3例，HR-/HER2-3例，無HR-/HER2+患者。

2.3乳腺癌ERBB3基因變異類型 本研究中檢測到ERBB3常見的突變類型為錯義突變，此外還有擴增、內含子突變。突變的熱點主要集中在胞外結構域Ⅱ以及激酶區，突變的熱點為V104L、E928G，見圖1。13例患者中有12例為ERBB3基因錯義突變(其中1例患者ERBB3基因發生G284A、E928G兩個位點的錯義突變)，1例患者檢測到ERBB3基因擴增。在12例基因錯義突變患者中，有1例患者檢測到ERBB3基因內含子突變。本研究檢測到的新突變位點為N522S、S300F、R678W、M760R、Q1301*。

注：Mutations為突變，ERBB3為人表皮生長因子受體3

2.4ERBB3基因突變蛋白功能損傷預測 PROVEAN、SIFT及Poly-Phen-2生物信息學軟件預測點突變對蛋白質改變產生的危害性，結果顯示，D297Y、T355I、E928G、E1261A、L431F、P583S、R667L、D297H、R678W位點的改變均可能對蛋白質結構或功能造成有害影響，見表1。

2.5Western blot檢測磷酸化ERBB3、Akt水平 人HER2陽性乳腺癌細胞BT474-V1、SKBR3-V1均不表達ERBB3蛋白。BT474-C1、SKBR3-C1均為重新構建的能夠表達ERBB3蛋白的人HER2陽性乳腺癌細胞。BT474-M1、SKBR-3-M1是慢病毒感染后構建的ERBB3基因E928G突變的人HER2陽性乳腺癌細胞。6組細胞中磷酸化ERBB3水平未見明顯改變，在BT474-M1、SKBR-3-M1兩組細胞中磷酸化Akt水平明顯升高，見圖2。

表1 ERBB3突變位點PROVEAN、SIFT、Poly-Phen-2 HumVar軟件評分

注：pERBB3為磷酸化人表皮生長因子受體3，pAkt為磷酸化蛋白激酶B,GADPH為3-磷酸甘油醛脫氫酶

3 討 論

既往研究發現，ERBB3基因擴增可促進腫瘤細胞生長分化，最終導致對藥物治療的敏感性降低[15]。多項研究發現，ERBB3擴增改變或ERBB3與其他HER家族成員形成異二聚化后，不易被降解，下游通路異常激活導致細胞增殖[16-17]，但對于ERBB3基因突變對腫瘤影響的研究較少。Yang等[18]發現ERBB3基因不同位點突變的胃腸道腫瘤對酪氨酸激酶抑制劑的敏感性不同，通過構建不同位點突變的腫瘤細胞發現E928G位點突變對耐藥的影響最大，影響藥物療效的機制可能與下游PI3K/Akt信號通路的異常激活相關[7]。ERBB3基因在乳腺癌方面的研究主要是基因擴增對腫瘤的影響，涉及基因突變的研究較少[19-20]，故本研究旨在探索ERBB3突變對乳腺癌治療的影響。

與以往研究不同，本研究從臨床患者樣本的數據出發，尋找ERBB3基因常見突變類型及突變熱點，主要研究潛在的有害突變位點對乳腺癌細胞功能的影響。本研究結果顯示，本中心與TCGA數據庫中均存在共同的突變熱點E928G及V104L，利用生物信息學軟件對檢測到的突變位點進行分析，因此能更快地篩選出潛在的有害突變位點。經過3個軟件分析顯示，E928G位點突變危害性更大，與以往文獻報道相同[18]。通過對突變細胞磷酸化Akt水平的檢測，驗證了ERBB3突變的HER2陽性乳腺癌細胞中磷酸化Akt水平升高，該結果可能與ERBB3基因構象改變相關。E928位點位于激酶區，該區域存在PI3K調節亞基位點，與PI3K相結合后激活下游通路，當E928位點發生改變，募集到更多的PI3K結合亞基位點，下游PI3K/Akt信號通路活化水平提高，可能導致腫瘤細胞發生耐藥[21-22]。

綜上所述，ERBB3基因E928G突變可引起細胞內磷酸化Akt水平升高，可能使下游PI3K/Akt信號通路過度激活，導致耐藥的發生。本研究為HER2陽性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥的機制研究提供了新方向，同時也為多靶點聯合治療提供了新思路。但本研究存在的不足主要是未進行臨床標本的驗證，有待后續的藥物相關性研究進行補充。