尿液HPV檢測在宮頸癌篩查中的臨床應用價值

宋金維，王建東

(1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院婦瘤科，北京 100026； 2.北京市西城區婦幼保健院婦產科，北京 100054)

根據2018年全球統計數據顯示，全世界每年有超過32萬的女性死于宮頸癌，其中85%的死亡病例發生在發展中國家[1]。高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持續感染已被流行病學和生物學證明是引起宮頸癌及癌前病變的必要因素[2]，但一定比例的女性由于主觀或客觀原因錯過早期診斷機會，因此選擇一個舒適性更強、更簡便的、可以由患者自行采樣的檢查方式可以提高宮頸癌前病變的診斷率，避免患者的不良預后[3]。感染HPV的子宮頸上皮細胞脫落后隨著宮頸分泌物進入陰道內，這些分泌物積聚在陰道口和小陰唇附近，當患者排尿時，尿液會將這些上皮細胞沖走，因此尿液中可以檢測出HPV DNA[4]。多項研究顯示，尿液標本與宮頸標本檢測結果有相當的一致性[5-6]，且具有非侵入性、無創傷性、方便易行等優點，在不方便進行宮頸侵入性篩查方面顯現出絕對的優勢[7-9]。本研究旨在通過對符合條件的患者留取初段晨尿標本，在陰道鏡檢查前取宮頸脫落細胞標本，分別進行HPV分型檢測，探討尿液HPV檢測在宮頸癌篩查中的臨床應用價值，為宮頸癌的篩查提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年12月1日至2018年3月31日在首都醫科大學附屬北京婦產醫院就診的498例患者的尿液標本及宮頸脫落細胞標本。納入標準：①年齡20～60歲；②具有完整子宮；③異?；虿淮_定的宮頸癌篩查結果[宮頸細胞學異常和(或)宮頸HPV高危型陽性]或癥狀、體征提示宮頸癌可疑或不明原因的陰道異常出血、排液等需要進一步陰道鏡檢查。排除標準：①有臨床妊娠的可疑癥狀；②有泌尿系統腫瘤；③子宮切除史；④宮頸外科手術史；⑤盆腔放療史；⑥相關數據缺乏；⑦拒絕參與或拒絕簽署留取相關標本知情同意書。本研究經首都醫科大學附屬北京婦產醫院醫學倫理委員會批準(倫理批準號：2017-KY-042-01)，患者均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1尿液標本HPV DNA提取 ①尿液的留?。涸?2 h內無性生活、無陰道出血、無陰道沖洗和陰道上藥前提下，于陰道鏡檢查當日患者自取初段晨尿約10 ml置于尿液自取裝置的管中(管內有固定液)送檢。②尿液的保存：尿液+緩沖液，混勻，過濾，20 min離心濃縮，同一患者尿液分為3份，分別室溫、4 ℃和-20 ℃保存。隨機抽取3例患者，共9份標本先采用離心柱法提取尿液中的HPV DNA，然后進行檢測，結果顯示3例患者9份尿液標本的合格率為100%，均成功完成檢測，室溫、4 ℃和-20 ℃保存的標本檢測結果無差異。實驗采用4 ℃保存，長期保存則放入-20 ℃。③尿液HPV DNA提取：尿液標本離心，去上清，加入蛋白酶K，混勻；加入細胞裂解液，震蕩混勻，15～20 min，期間顛倒混勻數次，溫浴后加入異丙醇充分混勻，轉入帶硅膠柱的離心管中，9 500×g離心1 min，棄液；重復離心；更換離心管，放入吸附柱，靜置1～2 min，吸附柱中加入洗脫緩沖液洗脫，靜置2～5 min，11 500×g離心2 min，棄柱得HPV DNA。

1.2.2宮頸標本HPV DNA提取 ①宮頸標本采集及保存：陰道鏡醫師使用一次性宮頸脫落細胞采集器置于宮頸口，順時針旋轉3～5圈，將宮頸脫落細胞固定于標本管內，做好標識并送檢。如不能立刻送檢標本，則4 ℃保存，并于2周內進行檢測。剩余標本于-20 ℃保存液中保存備查，保存期為6個月。凍融次數不超過7次，標本運送采用低溫保存運輸。②宮頸HPV DNA提?。簩m頸標本離心，棄上清液，加入細胞保存液重懸細胞，16 100×g離心1 min，棄上清液；加入細胞裂解液，充分振蕩重懸細胞，煮沸10 min，16 100×g離心10 min,保留上清液備用(上清液中為釋放的HPV DNA)。

1.2.3宮頸及尿液HPV分型檢測 將提取到的HPV DNA采用廣東凱普生物有限公司提供的聚合酶鏈反應擴增技術(聚合酶鏈反應混合液+DNA聚合酶+DNA)完成所有標本的23種HPV分型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、53、73、82、6、11、42、43、44、81)檢測。

1.3統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計數資料用例(%)表示，以宮頸HPV為標準，計算尿液HPV檢測的靈敏度、特異度及其95%CI，尿液和宮頸HPV檢測采用Kappa分析[10]行一致性檢驗，Kappa<0，代表一致性極差，Kappa 0～0.20，代表一致性微弱；Kappa 0.21～0.40，代表一致性弱；Kappa 0.41～0.60，代表一致性中等；Kappa 0.61～0.80，代表一致性強；Kappa 0.81～1.00，代表一致性極強。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同型別HPV在尿液和宮頸標本中的陽性分布 配對收集合格的498例尿液和宮頸標本用于分析，宮頸標本中HPV陽性率為83.73%(417/498)，尿液標本中HPV的陽性率為79.12%(394/498)。在23種HPV分型檢測(16、18 、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、53、73、82、6、11、42、43、 44、81)中，宮頸和尿液標本中檢測到的前3位常見類型分別是HPV16、HPV58、HPV52；高致病性HPV18型在宮頸和尿液標本中的陽性率分別為8.43%(42/498)和8.03%(40/498)。不同型別HPV在尿液和宮頸標本中的陽性分布見表1。

表1 不同型別HPV在498例尿液和宮頸標本中的陽性分布 [例(%)]

續表1

2.2尿液與宮頸HPV(9個型別)檢測的一致性比較 以宮頸HPV分型為標準，選擇與HPV九價疫苗相對應的9個型別(6、11、16、18、31、33、45、52、58)分析尿液與宮頸標本的一致性及尿液HPV的靈敏度和特異度。498例陰道鏡患者尿液標本的合格率為100%。在9個HPV型別中，尿液HPV檢測的靈敏度為68.75%～100.00%，特異度為96.13%～99.80%，一致性Kappa值為0.666～0.858，差異有統計學意義(P<0.001)。HPV6、11、31、33、45、52型的Kappa值為0.666～0.770，一致性強；HPV16、18、58型的Kappa值為0.838～0.858，一致性極強；差異均有統計學意義(均P<0.001)。見表2。

3 討 論

宮頸癌病因學的肯定使HPV檢測在全世界得到了廣泛推廣應用。目前高危型HPV的檢測方法基本均為侵入性，該方法存在以下問題：許多女性認為侵入性婦科檢查不舒服甚至疼痛、令人難堪，故依從性差；交通不便、工作繁忙、醫院檢測程序煩瑣也使得部分女性未參與檢測；對宮頸癌篩查的意識不足、缺乏健康教育和普查知識也使得大部分人群不參加檢測[11]。這些嚴重降低了女性HPV篩查的

表2 尿液與宮頸HPV(9個型別)檢測的一致性比較

依從性，尤其是接種疫苗后的青少年、妊娠婦女、受宗教文化和信仰影響的女性。因此，研究一種取樣方便、依從性好、靈敏度高、特異度佳的HPV檢測方法成為子宮頸癌防治研究中的熱點與難點。

國外一項薈萃分析顯示，與宮頸HPV檢測相比，尿液HPV檢測的靈敏度和特異度分別為87%和94%[12]。本研究中尿液HPV檢測的靈敏度為68.75%～100%，特異度為96.13%～99.80%，其中尿液HPV11、16、45、58型的靈敏度與上述研究相當，HPV18、31、33、52、6型的靈敏度均略低于上述研究。本研究對于高致病性的HPV16型和18型，尿液的靈敏度分別為88.18%和83.33%，特異度分別為96.13%和98.90%，Kappa值分別為0.838和0.841(P<0.001)，提示尿液HPV有較好的靈敏度和特異度。使用初段晨尿標本而不是隨機或中段尿標本，以及在標本采集和HPV DNA檢測中采取一些預防措施可大大提高靈敏度[13]。

巴西的一項橫斷面研究中，通過從妊娠的婦女中自行收集尿液和陰道標本，對高危型HPV(16、18、31、33、39、45、59)進行檢測，尿液和陰道標本的HPV DNA檢測結果基本一致(P<0.000 1)[14]，表明尿液可能是孕婦HPV檢測的可靠標本。本研究中HPV6、11、31、33、45、52型的Kappa值為0.666～0.770(P<0.001)，與上述研究相當；其余3個分型(16、18、58)的Kappa值均大于0.810，最高為0.858(P<0.001)，其一致性高于上述研究。尿液HPV檢測具有非侵入性、取樣方便等特點，使得妊娠期婦女有更高的HPV篩查依從性。一項研究表明，人類免疫缺陷病毒感染的女性由于免疫抑制等導致HPV感染率增加，從而導致發展為宮頸癌的風險增加[15]。Ferenczy等[16]報道，人類免疫缺陷病毒陽性的女性留取尿液行HPV檢測，并與宮頸標本配對比較，發現HPV感染的一致性為73.6%。Munoz等[17]對人類免疫缺陷病毒感染的婦女使用自我采集的尿液標本與宮頸標本進行檢測，結果顯示HPV的靈敏度為68.8%，特異度為50.0%。由此可見，在宮頸癌控制和預防項目中，如何提高覆蓋率、采樣率、依從性和隨訪率，特別是那些呈現某種免疫抑制類型的婦女起著決定性的作用。自我采樣方法(如尿液采樣)因診斷性能良好且女性的接受度高，可作為預防病理學的有效方式。

Vorsters等[18]對注射HPV疫苗后女性的尿液標本和血清標本中HPV抗體滴度進行比較，結果顯示尿液中IgA和IgG含量約是血清中的0.15%和0.35%，與未注射疫苗的女性相比，注射疫苗的女性HPV16、6、11、18型的抗體含量顯著增加，提示疫苗可增加尿液中的抗體，可以考慮使用尿液進行HPV疫苗效果評價。本研究中，尿液標本中HPV16、58、53、81、51、59、39、43、6、45、35、11型的陽性率均高于宮頸標本，HPV44型的尿液和宮頸標本陽性率相等，均為4.42%。從長期來看，高敏感性的尿液HPV檢測可能會促進高覆蓋率的HPV疫苗接種計劃[19]。我國人群的HPV感染統計數據基本都是源于醫院就診和體檢，缺少基于社區人群的有代表性的全國性數據。HPV感染除可導致宮頸癌外，還可引起外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、喉癌、口腔癌和口咽癌等，目前國內流行病學方面此類研究較少。因此，我國人群HPV感染的全國性數據、疾病負擔、流行病學等研究需進一步規范化、系統化開展[20]。一項研究分析顯示，以預防宮頸癌為價值標準，液基薄層細胞學檢查聯合HPV高危分型篩查效果最好[21]，HPV高危分型篩查成本效果最優。篩查人群的接受度和依從性變化影響篩查方案的成本效果，且初篩接受率和陰道鏡轉診率的變化將影響結果排序。因此，提高人群的依從性和接受度，有利于完善我國宮頸癌防控體系，從而有效提高宮頸癌的防治效果。

有文獻研究顯示，自收集尿液進行HPV檢測是監測HPV流行狀況和女性HPV疫苗接種效果的宮頸取樣的一種潛在替代方法。尿液HPV檢測可能彌補宮頸HPV檢測和細胞學檢查的不足[22]。但是尿液采樣、儲存條件、DNA提取和DNA擴增檢測均可能對HPV DNA檢測和檢測到的病毒DNA形式產生重要影響，從而導致在各研究中尿液HPV檢測的靈敏度和特異度有較大差異。

綜上所述，尿液HPV與宮頸HPV檢測對宮頸癌篩查有較好的一致性，適用于不具備侵入性宮頸HPV檢測的宮頸癌早期篩查及HPV疫苗接種后的效果評價，可有效地預防和減少女性宮頸癌的發生，從而保證廣大婦女的身體健康。