Hedgehog通路關鍵基因在腦膠質瘤中表達模式的相關研究

王仕超，任曉敏，潘園園，李霞

(呼和浩特市第一醫院臨床醫學實驗室，呼和浩特 010010)

Hedgehog(Hh)信號通路在胚胎發育過程中高度保守并起到樞紐作用，負責調節組織分化、維持組織穩態以及干細胞的干性等[1-2]。Hh信號通路的失調與多種腫瘤發生密切相關，如基底細胞癌、腦膠質瘤、肺癌及消化道腫瘤等[3-4]。常春藤膠質細胞瘤圖譜項目(Ivy Glioblastoma Atlas Project，Ivy-GAP)[5]是一個建立在解剖學基礎上的人類膠質母細胞瘤的轉錄圖譜，其通過極為嚴格的組織病理學篩選收納了41例膠質母細胞瘤患者的病理組織，從每個腫瘤的不同病理區域分離出122個樣本，利用激光顯微切割系統對腫瘤組織由內而外進行如下病理分區：腫瘤細胞區(cellular tumor，CT)、周圍細胞壞死區(pseudo-palisading cells around necrosis，CT-PAN)、增生性血管區(hyperplastic blood vessels in cellular tumor，CT-HBV)、腫瘤浸潤區(infiltrating tumor，IT)、前緣(the leading edge，LE)，并在相應區域分離RNA獲得各區間基因的信使RNA(messenger RNA，mRNA)表達量用以后續分析。此數據庫創建了更為全面的膠質母細胞瘤細胞發生變異的可疑分子集合，能夠更加深入地研究腫瘤異質性。本研究數據主要來源于Ivy GAP-艾倫腦科學研究所數據庫平臺提供的較為客觀的病理組織測序等結果，并利用此平臺對Hh信號通路的8個關鍵基因 CDO兄弟同源物(brother of CDO，BOC)、SMO(Smoothened)、CDON(cell adhesion associated，oncogene regulated)、PTCH1(Patched 1)、GAS1(growth arrest specific 1)、HHIP(Hedgehog inte-racting protein)、腦膠質瘤相關癌基因同源物(glioma-associated oncogene homolog，GLI)、SHH(Sonic Hedgehog)在不同的腦膠質瘤病理分區、分子亞型、甲基化與否等條件下呈現的表達模式進行分析，以評估這些基因在腦膠質瘤發生發展過程中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1數據支持 征募患者的臨床和基因組數據可在Ivy GAP臨床和基因組數據庫(ivygap.swedish.org/home)中獲得。在Ivy GAP數據庫下載頁面(http://glioblastoma.alleninstitute.org/static/download.html)主要顯示兩部分內容，第一部分為腫瘤、解剖結構(腫瘤特征)及研究樣本的概要信息，包括患者及腫瘤信息、每個腫瘤亞塊的圖像及解剖結構、每個腫瘤亞塊各解剖結構的基因表達列表、研究樣本的RNA-Seq數據；第二部分為RNA測序數據，包括所有樣本的歸一化基因水平FPKM值(如RNA-Seq頁面)(zip)，每個樣本的非標準化基因級FPKM和TPM值的文件URL (csv)，用于處理RNA-Seq數據的參考基因組(zip)等一系列相關文件。

1.2數據方案 基于上述平臺提供的數據支持，本研究主要針對Hh信號通路的關鍵基因在腦膠質瘤的不同病理分區、分子亞型[6]、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)基因突變及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyl-transferase，MGMT)基因甲基化狀態4個層面進行深入分析，主要分析依據為基因的mRNA表達水平。

①分析Hh信號通路的8個關鍵基因(BOC、SMO、CDON、PTCH1、Gas1、HHIP、GLI、SHH)在腦膠質瘤的5個病理分區(CT、CT-PAN、CT-HBV、LE、IT)的表達模式。LE部分腫瘤細胞與正常細胞的比值為(1～3)∶100。IT是位于LE和CT之間的中間條帶，通常以星狀突起為標志。CT作為腫瘤組織的核心區域，其腫瘤細胞與正常細胞的比例為100∶1～500∶1。CT-PAN是由假胞質樣細胞形成的一段狹窄壞死邊界，CT-HBV是一種在腫瘤中隨處可見的內壁增厚的血管增殖區域。②分析上述基因在經典型、神經元型、間質型、前神經元型4個分子亞型間的表達模式。③對選取的樣本根據IDH基因是否變異、是否進行MGMT基因甲基化進行分組，結合上述基因的mRNA水平進行收集和整理數據。

1.3統計學方法 利用R編程語言對Hh信號通路的關鍵基因在腦膠質瘤組織結構、臨床參數、基因組數據等方面的基因表達值繪制箱形圖和熱圖，并進行統計分析。采用Mann-Whitney檢驗評估樣本組間的差異，采用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn′s多重檢驗進行多重比較計算中位數，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Hh信號通路的8個關鍵基因表達與腦膠質瘤不同病理分區的關系 BOC、SMO、Gas1在CT的表達水平最高，在LE的表達水平最低，且BOC與SMO在幾個病理分區間的表達模式類似，隨著腫瘤組織核心區由內而外的擴展表達水平呈下降趨勢。CDON在CT-PAN的表達水平最高，與其他4個病理分區比較差異均有統計學意義(均P<0.001)。PTCH1在CT的表達水平與CT-HBV及CT-PAN比較差異有統計學意義(P<0.05)，與LE、IT比較差異無統計學意義(P>0.05)。HHIP的表達水平由腫瘤向臨界組織延伸而隨之增高，在 LE表達水平最高，而SHH、GLI在5個病理分區間的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，表達水平接近為零。見圖1。

2.2Hh信號通路的8個關鍵基因表達與腦膠質瘤不同分子亞型的關系 BOC與SMO在間質型腦膠質瘤組織內的表達水平高于其他亞型(P<0.05)，在前神經元型腦膠質瘤組織內表達水平最低。CDON和PTCH1的表達模式與BOC和SMO相反，在前神經元型腦膠質瘤組織中表達水平最高；GAS1在經典型腦膠質瘤組織內的表達水平高于前神經元型腦膠質瘤(P<0.01)。HHIP、SHH、GLI在4個分子亞型中的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：BOC為CDO兄弟同源物，SMO為Smoothened，CDON為cell adhesion associated，oncogene regulated，PTCH1為Patched 1，GAS1為growth arrest specific 1，HHIP為Hedgehog interacting protein，GLI為腦膠質瘤相關癌基因同源物，SHH為Sonic Hedgehog，CT為腫瘤細胞區，CT-HBV為增生性血管區，CT-PAN為周圍細胞壞死區，IT為腫瘤浸潤區，LE為前緣；*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001

注：BOC為CDO兄弟同源物，SMO為Smoothened，CDON為cell adhesion associated，oncogene regulated，PTCH1為Patched 1，GAS1為growth arrest specific 1，HHIP為Hedgehog interacting protein，GLI為腦膠質瘤相關癌基因同源物，SHH為Sonic Hedgehog；*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001

2.3Hh信號通路的8個關鍵基因表達與腦膠質瘤IDH基因突變的關系 IDH基因突變組CDON與PTCH1的表達水平顯著高于IDH基因野生型組(P<0.05)，SHH、SMO、GLI、BOC、HHIP的表達水平低于IDH基因野生型組(P<0.05)，兩組間GAS1的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4Hh信號通路的8個關鍵基因表達與腦膠質瘤MGMT基因甲基化的關系 MGMT基因甲基化組的GAS1、BOC、SHH表達水平高于MGMT基因非甲基化組(P<0.05)；PTCH1、HHIP、GLI表達水平低于MGMT基因非甲基化組(P<0.05)；兩組間SMO、CDON的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：IDH為異檸檬酸脫氫酶，SHH為Sonic Hedgehog，SMO為Smoothened，CDON為cell adhesion associated，oncogene regulated，GLI為腦膠質瘤相關癌基因同源物，GAS1為growth arrest specific 1，BOC為CDO兄弟同源物，PTCH1為Patched 1，HHIP為Hedgehog interacting protein

注：MGMT為O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶，SHH為Sonic Hedgehog，SMO為Smoothened，CDON為cell adhesion associated，oncogene regulated，GLI為腦膠質瘤相關癌基因同源物，GAS1為growth arrest specific 1，BOC為CDO兄弟同源物，PTCH1為Patched 1，HHIP為Hedgehog interacting protein

3 討 論

既往研究發現，Hh信號通路的異常激活與多種腫瘤的發生密切相關[6-8]，而Hh信號通路調控腦膠質瘤的發生機制尚未明確。本研究通過對Ivy GAP-艾倫腦科學研究所綜合數據庫的分析，闡述了Hh通路中關鍵基因表達的瘤間和瘤內異質性[7]以及這些基因表達的潛在預后意義。

按照該數據庫對腦膠質瘤組織的病理劃分標準，腫瘤核心區較其他病理分區腫瘤細胞分布最為密集，因此腫瘤核心區的基因表達差異在腫瘤分子層面也最具有代表性。SMO作為Hh通路的效應蛋白被證實其表達增高與多種腫瘤的惡性增殖相關[8]。本研究中，BOC、SMO、Gas1在CT的表達水平最高，在LE的表達水平最低；且BOC與SMO在幾個病理分區間的表達模式高度相似，即隨著腫瘤組織核心區由內而外的擴展表達水平呈下降趨勢，提示BOC作為SMO上游的跨膜蛋白可能調控SMO的表達。CDON在CT-PAN的表達水平最高，與其他4個病理分區比較差異均有統計學意義(P<0.001)，可能與胚胎期神經管發育過程中CDON具有促凋亡作用[9]有關；同時，CDON也被描述為一種依賴性受體，在SHH缺失的情況下觸發細胞凋亡，這種CDON促凋亡活性被認為可以抑制腫瘤進展。

PTCH1基因作為腫瘤抑制因子發揮作用，其基因突變與基底細胞痣綜合征、食管鱗狀細胞癌、毛母細胞瘤、膀胱移行細胞癌以及無腦畸形有關[10]。本研究結果顯示，PTCH1在CT的表達水平與CT-HBV及CT-PAN比較差異有統計學意義(P<0.05)，與LE、IT比較差異無統計學意義(P>0.05)。推測可能與PTCH1通過選擇性剪接可編碼不同亞型的多個轉錄本有關。有研究在胃癌與胃上皮肉瘤中進行HHIP mRNA定量檢測發現，在胃癌組織內HHIP的表達水平明顯下降[11-12]。本研究中HHIP在不同病理分區的表達模式與其他基因相反，其表達水平由腫瘤核心向臨界組織延伸而隨之增高，在LE表達水平最高，與上述研究結果一致。且本研究結果顯示，SHH、GLI在5個病理分區間的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，但目前已有研究證實Hh信號通路的兩個主要基因(SHH、GLI)與腦膠質瘤的惡性增殖顯著相關[13-14]，且迄今尚未發現關于在腦膠質瘤不同病理學分區中對SHH、GLI表達進行分析的報道，推測原因可能為該數據庫利用二代測序技術對靶向基因進行測序，而針對SHH、GLI基因進行檢測的探針設計存在偏差，但此結論還有待進一步證實。

本研究中，BOC與SMO在間質型腦膠質瘤組織內的表達水平高于其他亞型(P<0.05)，與學者利用TCGA數據庫進行分析的研究結果[15-16]一致。間質型膠質母細胞瘤中NF1等致癌基因過表達，誘導蛋白激酶B信號通路異常激活、腫瘤壞死因子超家族及核因子κB信號通路高表達，導致此類型腦膠質瘤的壞死率較高和腫瘤侵襲性較強，預后極差[17]。上述結果提示，BOC與SMO可能在間質型腦膠質瘤細胞內存在某些調控關系，兩者均可激活Hh通路，進一步誘導腫瘤細胞惡性增殖和侵襲。本研究結果顯示，PTCH1、CDON在前神經元亞型腦膠質瘤組織中表達水平最高，提示這兩個基因在腦膠質瘤的發病過程中可能起到類似抑癌基因的作用；HHIP、SHH、GLI在4個分子亞型中的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，分析其原因為這4種亞型的腦膠質瘤并非獨立存在，同一患者腦膠質瘤內不同微環境中可能分布著不同亞型表現的腦膠質瘤起始細胞或腦膠質瘤干細胞，因此腫瘤異質性可能會影響某些基因的表達模式[18]。

IDH1/2基因參與細胞代謝，其發生突變后影響腫瘤的發生發展。腦膠質瘤患者若存在IDH1或IDH2基因突變，則腫瘤內部血管的分布密度降低，腫瘤細胞的增殖速度減慢，侵襲程度降低，患者預后較好[19-20]，因此明確IDH1/2基因突變與否能夠特異性指導靶向治療。本研究結果顯示，IDH基因突變組CDON與PTCH1的表達水平顯著高于IDH基因野生型組(P<0.05)，提示CDON及PTCH1的表達可能受IDH基因突變體高甲基化調控，在腫瘤的發生發展中可能發揮抑癌基因的功能。IDH1/2基因未突變型腫瘤主要通過升高缺氧誘導因子-1表達水平，促使線粒體對氧消耗的需求增加并降低活性氧聚集等途徑來改變腫瘤細胞的代謝途徑。本研究中，IDH基因突變組SHH、SMO、GLI、BOC、HHIP的表達水平低于IDH基因野生型組(P<0.05)，原因可能為上述基因通過Hh信號轉導通路參與了細胞能量代謝過程，影響腦膠質瘤的預后。

MGMT基因表達增高能對抗烷化劑藥物殺傷腫瘤細胞的作用，啟動耐藥機制[21-22]。其啟動子區CpG島的過度甲基化會降低基因的表達，此類型腦膠質瘤患者生存期延長。本研究結果顯示，MGMT基因甲基化組的GAS1、BOC、SHH表達水平高于MGMT基因非甲基化組(P<0.05)；PTCH1、HHIP、GLI表達水平低于MGMT基因非甲基化組(P<0.05)；兩組間SMO、CDON的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示上述基因可能獨立于MGMT基因甲基化通過Hh信號通路調控腫瘤的發生。

綜上所述，Hh通路上BOC、SMO、CDON等關鍵基因在腦膠質瘤組織中呈現不同程度的表達差異，參與調控腦膠質瘤的不同發展過程。近年來，腦膠質瘤的分子生物學分型及腫瘤異質性被越來越多的研究者關注，但腫瘤異質性與治療耐藥性導致腦膠質瘤對單一靶點治療的反應有限。本研究初步闡述了Hh通路多個關鍵基因與腦膠質瘤發生發展及預后的潛在關系，可為后期多靶點、多機制聯合治療腦膠質瘤提供理論基礎。