外周血RNF180基因甲基化檢測(cè)在胃癌臨床診斷中的研究進(jìn)展

趙路瑤，李慕然，劉艷迪

(1.南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071； 2.天津市人民醫(yī)院消化科，天津 300121)

胃癌具有高發(fā)病率、高病死率的特點(diǎn)，2018年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出，胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，病死率居第3位[1]。近年來(lái)，我國(guó)胃癌的發(fā)病率有所下降，但人口增長(zhǎng)和老齡化導(dǎo)致的新發(fā)病例數(shù)量大幅上升。胃癌是我國(guó)第三大惡性腫瘤，病死率居惡性腫瘤的第2位[2]。我國(guó)胃腸道惡性腫瘤的相關(guān)死亡率明顯高于西方國(guó)家，其主要原因?yàn)榇_診較晚，約80%的胃癌患者確診時(shí)已為中晚期，即使接受以手術(shù)為主的綜合治療，5年生存率僅為30%～40%[3]。而早期胃癌患者的5年生存率超過(guò)90%[4]。因此，在臨床前或癥狀前階段發(fā)現(xiàn)并確診是成功治療和改善胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。

目前，胃癌的確診仍依靠胃鏡下病變組織的病理組織檢查，而胃癌分期分級(jí)依賴影像學(xué)檢查。內(nèi)鏡與影像學(xué)檢查均受診斷醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)、水平等因素的影響，缺乏量化標(biāo)準(zhǔn)。臨床常用的腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原、糖類抗原(carbohydrate antigen，CA)19-9和CA72-4等雖然可以量化，但其胃癌檢出率僅約20%[5-6]。因此，迫切需要尋找簡(jiǎn)便易行、敏感高效的胃癌檢測(cè)手段。環(huán)指蛋白(ring finger protein，RNF)180基因是一種抑癌基因，其甲基化與多種惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為相關(guān)[7-11]。外周血RNF180基因甲基化水平診斷胃癌的靈敏度和特異度較高，可能成為胃癌特異性生物標(biāo)志物[7]。現(xiàn)對(duì)外周血RNF180基因甲基化檢測(cè)在胃癌臨床診斷中的研究進(jìn)展予以綜述，以期為RNF180基因甲基化檢測(cè)在胃癌診斷中的價(jià)值提供新的理論基礎(chǔ)和研究方向。

1 RNF180概述

RNF180基因在人類基因組中定位于5q12.3，是一種受DNA甲基化調(diào)控的抑癌基因[12]。由RNF180基因編碼的RNF180蛋白與其他RNF家族成員均具有E3泛素連接酶活性，且屬于環(huán)指型E3s，其結(jié)構(gòu)含有1個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域、1個(gè)堿基卷曲結(jié)構(gòu)域(兩者可與蛋白質(zhì)結(jié)合)、1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(DSPRC)和1個(gè)被預(yù)測(cè)為跨膜區(qū)的C端疏水區(qū)[13]。見(jiàn)圖1。

注：DSPRC為新保守結(jié)構(gòu)域，basic coiled-coil domain為基本螺旋結(jié)構(gòu)域，RING finger domain為環(huán)指結(jié)構(gòu)域，TM為C端疏水區(qū)

在泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)中，經(jīng)過(guò)E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶等參與的具有高度特異性的級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)作用后，泛素化蛋白質(zhì)最終被26S蛋白酶體降解，以保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)平衡[14]。RNF180是E3泛素連接酶的成員，在UPS的功能中起著關(guān)鍵作用，決定了UPS泛素化的靶向特異性和時(shí)序性以及隨后蛋白質(zhì)的降解過(guò)程[13,15]。同時(shí)，RNF180通過(guò)對(duì)自身泛素化進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，避免細(xì)胞內(nèi)E3泛素連接酶濃度過(guò)高。RNF180參與了多種生理和病理過(guò)程，通過(guò)介導(dǎo)蛋白降解在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄及修復(fù)中發(fā)揮不可替代的作用，如腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄活化因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子以及突變產(chǎn)生的癌蛋白或受損蛋白質(zhì)是UPS泛素化降解的靶蛋白[16]。當(dāng)RNF180基因甲基化時(shí)，RNA聚合酶不能有效地與RNF180啟動(dòng)子結(jié)合，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制、翻譯受損[17]，RNF180表達(dá)減少，引起E3泛素連接酶功能障礙和UPS失調(diào)，失調(diào)的UPS可終止蛋白質(zhì)降解過(guò)程，引起細(xì)胞代謝紊亂，機(jī)體蛋白質(zhì)降解受限達(dá)到一定水平時(shí)，可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。此外，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，甲基化累積持續(xù)進(jìn)行，最終導(dǎo)致多種惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生[18]。

2 RNF180相關(guān)的癌癥作用機(jī)制

從病因?qū)W角度看，幽門(mén)螺桿菌是一種參與胃癌發(fā)生的Ⅰ類致癌物[19-20]。Han等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在不同的疾病條件下，幽門(mén)螺桿菌感染可能改變RNF180基因啟動(dòng)子的甲基化方式，在正常或淺表性胃炎中，幽門(mén)螺桿菌傾向于影響總體甲基化狀態(tài)，而不會(huì)使某些CpG位點(diǎn)甲基化；但在萎縮性胃炎中，幽門(mén)螺桿菌影響某些CpG位點(diǎn)的可能性更大。進(jìn)一步的研究證實(shí)，有5個(gè)CpG位點(diǎn)與萎縮性胃炎進(jìn)展相關(guān)，其中兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化與胃癌進(jìn)展相關(guān)，這些位點(diǎn)均位于RNF180基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域(-202/+372)，該區(qū)域也是RNF180基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)[16,22]。故認(rèn)為，幽門(mén)螺桿菌通過(guò)促進(jìn)RNF180基因甲基化參與慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生到腸型胃癌的演變。

RNF180與胃癌的關(guān)系一直是研究熱點(diǎn)，但對(duì)其致癌機(jī)制的研究很少。Cheung等[22]的研究顯示，受檢的胃癌細(xì)胞系中均未發(fā)現(xiàn)RNF180基因的缺失或突變，認(rèn)為啟動(dòng)子高甲基化是降低RNF180表達(dá)的主要機(jī)制；RNF180可通過(guò)上調(diào)組織金屬蛋白酶抑制物3和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A激活細(xì)胞凋亡，并通過(guò)上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A抑制細(xì)胞增殖。Deng等[23]利用基因芯片技術(shù)的研究顯示，RNF180在HGC-27-GFP-RNF180細(xì)胞(轉(zhuǎn)染RNF180表達(dá)載體的HGC-27胃癌細(xì)胞)中重新表達(dá)，可顯著抑制涉及增殖(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、侵襲(基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶14)、淋巴管生成(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D)、胃癌細(xì)胞趨化性細(xì)胞因子(CC趨化因子受體7)基因的表達(dá)，表明RNF180可能成為胃癌的治療靶點(diǎn)。由此可見(jiàn)，RNF180基因甲基化可通過(guò)影響多種細(xì)胞因子、癌蛋白調(diào)控癌細(xì)胞生物學(xué)行為。

涉及RNF180致癌機(jī)制的4條信號(hào)通路分別為RNF180/RhoC/磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)、RNF180/Wnt1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1(Wnt1-inducible signaling pathway protein 1，WISP1)、RNF180/Polo樣激酶2和RNF180/DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferase 3A，DNMT3A)/含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶 9(A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs 9，ADAMTS9)。Wu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，RNF180可結(jié)合RhoC并通過(guò)泛素化作用降解RhoC。RhoC通過(guò)磷酸化活化STAT3生成磷酸化的STAT3，后者發(fā)生二聚化后擴(kuò)散到細(xì)胞核中，與Nanog的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，開(kāi)啟基因表達(dá)。而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶14、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D相關(guān)基因是STAT3的靶基因。因此，磷酸化的STAT3水平下降可有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Wei等[8]對(duì)RNF180與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，WISP1是介導(dǎo)RNF180腫瘤抑制作用的關(guān)鍵下游分子。在機(jī)制上，RNF180中位點(diǎn)Lys50、Lys190、Lys268的泛素化可使WISP1泛素化，導(dǎo)致WISP1下調(diào)，進(jìn)而減弱WISP1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，最終抑制人源性腫瘤組織異種移植小鼠模型結(jié)直腸癌腫瘤的生長(zhǎng)。

此外，5-氟尿嘧啶和RNF180在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)方面有協(xié)同作用。RNF180不能完全消除WISP1的影響，這意味著WISP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中可能存在替代介質(zhì)或途徑。Cao等[11]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，RNF180可與Polo樣激酶2結(jié)合并促進(jìn)Polo樣激酶2泛素化降解，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。DNMT3A是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，與ADAMTS9基因啟動(dòng)子的高甲基化密切相關(guān)。Sun等[25]發(fā)現(xiàn)，ADAMTS9可抑制胃癌細(xì)胞存活、遷移和侵襲，進(jìn)一步的共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，RNF180可與DNMT3A結(jié)合，泛素化分析結(jié)果顯示，RNF180過(guò)表達(dá)時(shí)，DNMT3A泛素化增強(qiáng)，證實(shí)DNMT3A是RNF180的直接底物，RNF180通過(guò)促進(jìn)DNMT3A蛋白的泛素化降解，恢復(fù)胃癌細(xì)胞中ADAMTS9的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的存活。上述信號(hào)通路均涉及RNF180的泛素化作用，且許多參與重要細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的因子、關(guān)鍵酶均是RNF180下游分子，其中多種基因及信號(hào)通路相互影響，形成復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，因此還需進(jìn)一步探索RNF180抑制胃癌惡性生物學(xué)行為的其他通路。進(jìn)一步研究RNF180上下游分子信號(hào)將為尋找胃癌治療新靶點(diǎn)、延長(zhǎng)胃癌患者生存期提供理論基礎(chǔ)。

3 胃癌中外周血RNF180甲基化的臨床檢測(cè)

胃癌組織中RNF180信使RNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)是既往研究的熱點(diǎn)，結(jié)果顯示，胃癌組織中RNF180信使RNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，且病變組織水平顯著低于相應(yīng)癌旁組織[7,23,26]。外周血取材方便，故外周血RNF180甲基化水平檢測(cè)被認(rèn)為是胃癌診斷的新方法。Cheung等[22]在研究胃癌細(xì)胞株及胃癌組織的同時(shí)，利用定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)胃癌患者血漿標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，56%(18/32)的患者血漿標(biāo)本存在RNF180基因甲基化，而健康人群血漿中未檢測(cè)到RNF180基因甲基化，受試者工作特征曲線下面積為0.685，靈敏度為91%，特異度為63%；Logistic回歸分析證實(shí)，RNF180基因甲基化與胃癌高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(OR=16.1，95%CI5.3～48.6)。可見(jiàn)，外周血可顯示RNF180基因甲基化信息，且更易獲取，故外周血DNA甲基化水平的檢測(cè)為無(wú)創(chuàng)胃癌檢測(cè)提供了新途徑。研究顯示，與健康對(duì)照者相比，胃癌患者的血漿RNF180基因甲基化率明顯升高，且甲基化程度與腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[27-28]。但張學(xué)松等[28]利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)RNF180基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，胃癌患者血漿RNF180蛋白表達(dá)水平明顯降低，但蛋白質(zhì)表達(dá)水平與上述臨床病理學(xué)特征并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系，其原因可能是RNF180可通過(guò)基因甲基化之外的方式調(diào)控基因表達(dá)，如基因突變、組蛋白修飾去乙酰化。在基因表達(dá)水平上，蛋白質(zhì)與病理特征無(wú)關(guān)，但以上結(jié)果仍提示外周血RNF180基因甲基化檢測(cè)是一種簡(jiǎn)便且具有應(yīng)用價(jià)值的胃癌診斷方法。宋毓飛等[29]采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行研究顯示，53.7%(36/67)的胃癌患者RNF180基因甲基化呈陽(yáng)性表達(dá)，而僅23.5%(12/51)的正常健康體檢者RNF180基因甲基化呈陽(yáng)性表達(dá)，甲基化與腫瘤分化程度、TNM分期顯著相關(guān)，但不同性別、年齡胃癌患者RNF180基因甲基化水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Logistic回歸分析顯示，RNF180基因甲基化水平與胃癌高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(OR=3.0，95%CI1.3～7.0)。曹長(zhǎng)琦等[30]對(duì)74例早期胃癌患者的研究顯示，早期胃癌組患者的RNF180基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于胃良性疾病組和健康對(duì)照組(32.4%比13.1%、5.3%)(P<0.01)，其受試者工作特征曲線下面積為0.636，但未發(fā)現(xiàn)RNF180基因甲基化與性別、年齡、Lauren分型、病理分化程度、解剖位置、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)，以上研究結(jié)果的差異可能與不同試驗(yàn)檢測(cè)方法、試劑盒對(duì)研究結(jié)果的影響不同有關(guān)。

雖然檢測(cè)胃癌患者外周血RNF180基因甲基化水平存在一定的假陽(yáng)性率，但其診斷價(jià)值仍高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物。將RNF180與其他具有診斷效能的基因聯(lián)合進(jìn)行甲基化檢測(cè)是提高胃癌診斷靈敏度和特異度的方法。Zhang等[27]比較外周血RNF180、死亡相關(guān)蛋白激酶1以及分泌型卷曲相關(guān)蛋白2單一基因檢測(cè)和多基因聯(lián)合檢測(cè)診斷胃癌的效能，結(jié)果顯示，外周血RNF180與分泌型卷曲相關(guān)蛋白2聯(lián)合檢測(cè)診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為85.96%和47.62%，可顯著提高胃癌臨床診斷率，適用于胃癌的診斷。宋毓飛等[29]認(rèn)為，外周血RNF180和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2聯(lián)合檢測(cè)胃癌的靈敏度和特異度分別為42.7%和88.2%，優(yōu)于單一檢測(cè)。曹長(zhǎng)琦等[30]發(fā)現(xiàn)，血漿Septin 9、RNF180聯(lián)合甲基化檢測(cè)診斷早期胃癌的靈敏度為40.5%，特異度為85.3%，較任一基因單獨(dú)檢測(cè)的靈敏度明顯升高；且不同檢測(cè)手段診斷胃癌的陽(yáng)性率依次為Septin 9聯(lián)合RNF180、RNF180、Septin 9、CA724、CA125、癌胚抗原、CA19-9。由此可見(jiàn)，早期檢測(cè)Septin 9與RNF180基因甲基化可作為一種臨床可行的簡(jiǎn)便檢測(cè)方法，用于胃部病變良惡性的輔助鑒別。臨床試驗(yàn)顯示，該試劑盒檢測(cè)胃癌的靈敏度為61.76%(420/680)、特異度為85.07%(456/536)[31]。2020年4月國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)胃癌篩查RNF180/Septin 9基因甲基化檢測(cè)試劑盒上市[32]。在臨床實(shí)踐中，兩種及兩種以上基因甲基化檢測(cè)似乎更加具有可行性。因此，尋找其他具有更高靈敏度的基因?qū)W標(biāo)志物是未來(lái)腫瘤診斷學(xué)的研究方向。

4 小 結(jié)

RNF180基因表達(dá)水平隨甲基化水平改變，并促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。外周血RNF180基因甲基化檢測(cè)有助于發(fā)現(xiàn)早期胃癌，且其檢測(cè)胃癌的靈敏度高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物[30]。外周血RNF180基因甲基化檢測(cè)在胃癌診斷、預(yù)測(cè)惡性生物學(xué)行為中具有重要價(jià)值，但其通過(guò)甲基化發(fā)揮促癌作用的具體機(jī)制仍不明確。目前與胃癌相關(guān)的分子標(biāo)志物主要包括癌基因、抑癌基因、DNA甲基化、微RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、外泌體等[33]。未來(lái)，基于腫瘤分子或免疫組織化學(xué)特征的檢測(cè)方法可通過(guò)優(yōu)化外周血RNF180基因甲基化檢測(cè)技術(shù)發(fā)掘其他具有高特異度和靈敏度的標(biāo)志物并進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，以進(jìn)一步探索定量、定性基因甲基化水平與胃癌的關(guān)系，拓展其在胃癌早期診斷中的應(yīng)用。