miRNA調控細胞焦亡及參與糖尿病腎病作用機制的研究進展

譚桂湘，鄒大威,2

(1.首都醫科大學，北京 100069; 2.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最重要的慢性并發癥之一[1]，也是全世界終末期腎病的主要原因[2]。近10年DN發病率呈現逐漸升高趨勢[3]，嚴重危害患者健康，但DN發病機制尚未完全闡明，臨床治療措施十分有限。細胞焦亡由Cookson和Brennan[4]于2001年提出，是一種促炎程序性細胞死亡。與其他細胞死亡相比，細胞焦亡的主要特點包括胱天蛋白酶(caspase)依賴性、在胞內形成炎癥小體和伴隨大量炎癥介質釋放等[5]；在形態學上，細胞焦亡主要表現為細胞膜破裂、染色質斷裂和核濃縮等。細胞焦亡參與多種疾病的發生發展[6-8]。近年研究表明，細胞焦亡可通過誘導炎癥加重DN腎臟損傷[9-10]。因此，調控細胞焦亡可能成為防治DN的新策略。

微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類內源性非編碼小RNA分子，主要通過功能基因的轉錄后調控參與多個生理過程[11]。研究顯示，miRNA對細胞焦亡的調控在多種疾病的進展中發揮重要作用[12-14]，且miRNA與細胞焦亡關系密切，但關于miRNA通過相關信號通路調控細胞焦亡的機制仍處于研究階段。另外，諸多文獻已報道miRNA在DN中異常表達并可通過氧化應激、免疫炎癥、細胞自噬等機制調節DN[15-16]。現通過查閱近年文獻，對miRNA調控細胞焦亡的分子機制，以及miRNA調控細胞焦亡參與DN進展的作用機制進行綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一種由20～24個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈RNA分子，具有組織特異性、進化保守性、表達階段性和基因簇集性等生物學特征，動物源性miRNA的基本合成加工過程首先是在細胞核中轉錄合成miRNA初級轉錄產物，之后其產物在Drosha酶的RNA水解酶作用下切割形成前體miRNA，再在轉運蛋白作用下移至細胞質中，并在Dicer水解酶作用下進一步切割產生成熟的miRNA[17-18]。成熟miRNA主要通過結合到信使RNA的3′端非翻譯區，對信使RNA進行剪切和降解,或者通過在轉錄后水平上抑制蛋白質翻譯來控制靶基因的表達。miRNA是機體重要的調節因子,至少60%的人體蛋白質編碼基因表達受到miRNA的調控，除此之外，miRNA在多個生物學過程中發揮重要作用和功能，如細胞增殖、分化、遷移、凋亡、癌變、血管生成、胰島素分泌、胚胎組織發育等。研究顯示，miRNA參與調控多種疾病的發生發展和轉歸，如糖尿病、胃癌、慢性心力衰竭等，并可作為這些疾病的有效治療靶點[12-14]。

2 miRNA調控細胞焦亡的機制

細胞焦亡受到多種因素直接或間接的調控，并且存在多條作用途徑，目前研究顯示對細胞焦亡的調控作用集中于對焦亡信號通路中關鍵靶蛋白的調節。根據其發生機制，細胞焦亡可分為caspase-1依賴型的經典焦亡通路和caspase-4/5/11依賴型的非經典細胞焦亡通路。在經典途徑中，模式識別受體與含caspase募集域的凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)共同作用招募caspase-1前體，組成炎癥小體[主要包括核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)1、NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2等][19]，進而激活caspase-1[20]，活化的caspase-1可激活消化道皮膚素D(gasdermin D，GSDMD)[21]，釋放其活性N端結構域在細胞膜上成孔，導致細胞焦亡，同時將活化caspase-1激活的白細胞介素(interleukin，IL)-18和IL-1β等炎癥介質釋放到胞外，誘導炎癥反應。在非經典途徑中，人體內caspase-4/5前體和小鼠體內caspase-11前體在結合細菌脂多糖后發生寡聚而活化[22]，活化的caspase-4/5/11可激活GSDMD、IL-18與IL-1β，在膜上打孔并釋放出細胞內容物，細胞發生焦亡。研究證實miRNA參與調控細胞焦亡，其主要作用機制與焦亡通路中相關分子密切相關，如NLRP3炎癥小體、ASC、GSDMD等，除此之外，miRNA還可與其他調節因子以及長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)相互作用，共同調節細胞焦亡[23]。

2.1miRNA通過調節焦亡通路相關分子表達直接調控細胞焦亡 在細胞焦亡通路中，ASC、caspase-1、NLRP3、GSDMD等分子表達水平升高既是細胞焦亡發生的主要特征，又是細胞焦亡發展的必要條件，通過靶向調節這些分子的表達，miRNA可直接調控細胞焦亡。Gu等[24]證實高糖可誘導人視網膜微血管內皮細胞發生細胞焦亡，其中miR-590-3p表達下降，NLRP1表達增加，熒光素酶報告實驗證實miR-590-3p可靶向作用于NLRP1。該模型中轉染miR-590-3p抑制劑可增強細胞焦亡，轉染miR-590-3p模擬物可減輕細胞焦亡。轉染干擾小RNA NLRP1后，再轉染miR-590-3p模擬物不能繼續降低細胞焦亡率，表明miR-590-3p可通過靶向NLRP1調節高糖誘導的細胞焦亡。Long等[25]發現在梅毒患者中miR-223-3p表達降低，caspase-1和IL-1β表達上調，同時發現膜免疫原rTp17可以誘導T蒼白球感染人臍靜脈內皮細胞(T pallidum-infected human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)焦亡，并通過給HUVECs轉染miR-223-3p抑制劑和模擬物，證實miR-223-3p可以抑制炎癥小體激活和細胞焦亡。通過熒光素酶實驗報告和過表達/敲減NLRP3的實驗，證實miR-223-3p可靶向調控NLRP3抑制細胞焦亡。Li等[26]用亞砷酸鹽誘導人肝細胞焦亡，細胞中miR-379-5p表達降低，GSDMD和裂解的caspase-1水平升高，1L-1β釋放增加，肝細胞轉染miR-379-5p模擬物使miR-379-5p過表達后，細胞中GSDMD和裂解的caspase-1表達降低，1L-1β釋放減少，細胞焦亡被抑制，結合熒光素酶報告基因檢測顯示GSDMD是miR-379-5p的直接靶標，證實miR-379-5p通過降低GSDMD表達抑制細胞焦亡。Han等[27]證實miR-22也可通過抑制GSDMD表達，進而抑制細胞焦亡。

2.2miRNA與調節焦亡的細胞因子相互作用發揮間接調控作用 許多分子如叉頭框轉錄因子O1(forkhead box O1,FoxO1)、A20蛋白、細胞因子信號轉導抑制物1(suppressors of cytokine signaling-1，SOCS-1)等雖然沒有直接參與焦亡通路，卻可作為調節因子參與細胞焦亡的調控，miRNA也能與這些調節因子相互作用，間接調控細胞焦亡。研究發現FoxO1可通過降低miR-148A表達，促進NLRP3炎癥小體激活，進而促進細胞焦亡[28]。Zeng等[29]用1-甲基-4-苯基-吡啶離子誘導人神經母細胞瘤細胞和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞焦亡，細胞中FoxO1表達升高，而miR-135b表達降低，過表達miR-135b后，細胞焦亡相關分子(如NLRP3炎癥小體、caspase-1和IL-1β)的表達被抑制，過表達FoxO1后可解除miR-135b對細胞焦亡的抑制作用，結合熒光素酶報告基因檢測顯示FoxO1是miR-135b的下游靶標，表明miR-135b通過作用于FoxO1抑制細胞焦亡。A20蛋白是炎癥信號轉導的中樞調節因子，可發揮抗炎作用。Ding等[30]采用高糖干預巨噬細胞源性內皮細胞與小鼠足細胞共培養誘導足細胞焦亡模型，其中miR-21-5p表達升高，過表達miR-21-5p后，A20蛋白表達減少，焦亡相關分子水平升高，根據熒光素酶報告基因檢測顯示A20是miR-21-5p的作用靶點，給實驗細胞轉染miR-21-5p抑制劑后，A20表達升高，焦亡相關分子水平下降，通過抑制A20表達，則可以消除這些影響，證實miR-21-5p通過靶向抑制足細胞中A20表達，促進焦亡相關分子表達，進而促進足細胞焦亡。此外，Xue等[31]研究證實A20是miR-21的直接靶點，敲除miR-21后，A20表達增加，抑制了NLRP3炎癥小體介導的caspase-1激活和IL-1β的分泌，ASC寡聚和再分配，以及GSDMD的裂解，進而抑制細胞焦亡。已證實SOCS-1可通過信號轉導及轉錄活化因子途徑抑制炎癥反應[32]，而miR-155可抑制SOCS-1的表達[33]。Li等[34]發現牙齦卟啉單胞菌可誘導巨噬細胞焦亡，細胞中miR-155表達顯著增加，而SOCS-1的水平降低，通過轉染短發夾miR-155使miR-155沉默后，SOCS-1表達增加，而細胞焦亡相關分子(NLRP3炎癥小體、IL-1β和IL-18等)表達均降低，表明miR-155通過抑制SOCS-1表達促進細胞焦亡。

2.3miRNA與lncRNA共同調控細胞焦亡 lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，在表觀遺傳學、轉錄前、轉錄和轉錄后水平上調節基因表達[35]。已發現的lncRNA在多種生物過程中起關鍵作用，如細胞增殖、凋亡、遷移、自噬和炎癥等，同時研究證實lncRNA參與調控細胞焦亡，而miRNA與lncRNA也能共同影響細胞焦亡[36]。Song等[37]用一水草酸鈣誘導人近端腎小管上皮(human kidney-2，HK-2)細胞焦亡，細胞中lncRNA LINC00339表達升高，miR-22-3p表達降低。過表達lncRNA LINC00339后可顯著提高HK-2細胞焦亡相關分子表達，而轉染miR-22-3p模擬物可起到相反的作用。lncRNA LINC00339可通過海綿吸附解除miR-22-3p對NLRP3炎癥小體的抑制，促進HK-2細胞焦亡。Mao等[38]研究發現，lncRNA Krüppel樣因子3反義RNA 1可通過下調miR-138-5p表達，降低NLRP3、ASC、裂解的caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18水平，進而抑制心肌細胞焦亡。Liang等[23]研究發現，lncRNA 母系表達基因3可靶向結合miR-485，提高黑色素瘤缺乏因子2炎癥小體表達，進而促進ASC、caspase-1和GSDMD的表達，誘導神經細胞焦亡。

3 miRNA調控細胞焦亡參與DN進展

細胞焦亡在DN的發生發展中起著重要作用[39]。目前認為，NLRP3炎癥小體/caspase-1/GSDMD通路是調節DN進展的細胞焦亡相關通路，如NLRP3炎癥小體的活化啟動了炎癥級聯反應、caspase-1介導了腎臟組織的損傷等。因此，調控細胞焦亡經典通路已成為防治DN的新熱點。DN的臨床表現包括腎小球濾過率下降、蛋白尿、腎功能進行性衰退，并最終發展為腎衰竭，其基本病理特征為腎小管間質纖維化、細胞外基質積聚、基膜增厚、腎小球肥大、腎小球系膜擴張等[40]。miRNA可通過調控DN腎臟固有細胞焦亡和炎癥反應，參與DN進展。

3.1腎小管上皮細胞 腎小管上皮細胞的損傷在DN早期已經出現，并與DN的后期進展密切相關[41-42]。Xie等[39]用高糖誘導HK-2細胞焦亡，細胞中NLRP3炎癥小體、caspase-1、IL-1β、GSDMD-N、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和miR-452-5p的表達升高，而lncRNA 生長阻滯特異性轉錄因子5(growth arrest-special transcript 5,GAS5)表達降低，在HK-2細胞轉染GAS5質粒或miR-452-5p的抑制劑后，lncRNA GAS5表達增加，miR-452-5p表達降低，細胞焦亡被抑制，結合熒光素酶報告基因檢測分析顯示lncRNA GAS5可靶向抑制miR-452-5p表達。因此，通過升高lncRNA GAS5的表達或者降低miR-452-5p的表達，可以抑制HK-2細胞焦亡和炎癥反應，進而延緩DN進展。

但是，同一個靶細胞往往受到多種miRNA的調控，而不同miRNA的作用往往不同甚至相反，如雖然miR-452-5p可以促進HK-2細胞焦亡，但是Zhu等[43]證實miR-506-3p可以抑制HK-2細胞焦亡和炎癥反應；Wang和Zhao[44]研究發現由于INK4基因座反義非編碼RNA(antisense non coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)解除了miR-497對硫氧還蛋白互作蛋白的抑制，NLRP3炎癥小體和caspase-1表達增加，促進HK-2細胞焦亡；Li等[45]研究發現lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1)可解除miR-23c對類胚胎致死性異常視覺基因1的抑制，促進NLRP3炎癥小體表達，促使HK-2細胞焦亡；Liu等[46]發現，在HK-2細胞焦亡中，lncRNA MALAT1對于miR-30c的抑制也起著重要作用。此時，若要通過抑制HK-2細胞焦亡治療DN，就要上調這些miRNA的表達水平，并抑制某些lncRNA的表達。

3.2足細胞 足細胞損傷是DN的最初標志之一，在DN發展中起重要作用[47]。Zuo等[48]用高糖誘導小鼠足細胞焦亡，細胞中caspase-1、GSDMD、NLRP3表達提高，lncRNA MALAT1和miR-200c-3p表達也升高，MALAT1基因敲除和miR-200c-3p干擾均可抑制高糖誘導的小鼠足細胞的焦亡，因此通過抑制lncRNA MALAT1和miR-200c-3p的表達，可對防治DN起到一定效果。此外，miR-21-5p可通過靶向抑制足細胞中A20表達，促進焦亡相關分子的表達，進而促進足細胞焦亡，加快DN進展[30]。

3.3腎系膜細胞 腎系膜細胞肥大、增殖和細胞外基質堆積是DN重要的病理標志[49]。李嶸等[50]用高糖誘導人腎系膜細胞焦亡，細胞中miR-497的表達顯著降低。給腎系膜細胞轉染miR-497模擬物使miR-497過表達后，細胞中IL-1β、TNF-α和caspase-1表達降低，細胞焦亡被抑制。通過生物信息學預測和熒光素酶報告基因檢測分析顯示，miR-497可直接靶向作用于NLRP1炎癥小體基因，同時根據蛋白質免疫印跡雜交結果顯示miR-497可抑制NLRP1炎癥小體表達，通過給細胞轉染NLRP1質粒使NLRP1炎癥小體過表達后，可解除miR-497對細胞焦亡的抑制作用，表明miR-497通過靶向抑制NLRP1炎癥小體表達，減少caspase-1表達和炎癥介質分泌，進而抑制腎系膜細胞焦亡與炎癥反應，延緩DN進展。Zhan等[51]用高糖溶液誘導大鼠腎系膜細胞焦亡，發現lncRNA 核富集轉錄體1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1)可通過靶向抑制miR-34c表達，促進NLRP3炎癥小體表達，進而促進大鼠腎系膜細胞焦亡和炎癥反應，加快DN進展，此時通過提高miR-34表達或抑制lncRNA NEAT1表達，可達到治療效果。

4 小 結

DN發病率高且預后差，即便使用目前最佳治療方案也不能完全防止DN患者發展到終末期腎病，因此需要進一步揭示DN發病機制。細胞焦亡是一種新發現的程序性細胞死亡，可作為機體的自我保護反應參與有害物質的清除，但過度的細胞焦亡會導致機體紊亂，誘發多種疾病。目前，高糖、脂代謝異常、氧化應激等DN危險因素對于細胞焦亡影響的研究，以及藥物干預調控焦亡抑制DN進展的研究，預示著通過細胞焦亡治療DN有望取得突破。miRNA的差異表達與多種疾病的發生、發展密切相關，其中miRNA對于細胞焦亡的調控起著重要作用。相關研究表明，miRNA對于細胞焦亡的調控主要集中于對焦亡通路中相關靶分子表達的調節，并能與多種調節因子以及lncRNA共同作用于細胞焦亡。另外，miRNA可通過調控DN腎臟固有細胞焦亡和炎癥反應參與DN進展，但miRNA的作用具有廣泛性和多樣性等特點，不同miRNA對于人體的影響還須更多實驗去驗證。相信隨著對細胞焦亡機制的進一步研究，以及更多miRNA靶點的發現，通過miRNA調控細胞焦亡來防治DN將會成為臨床治療DN以及新藥研發的重要思路。