活性小分子提高Par-4水平的研究進展

莫安娜，謝旭，廖海緣，唐美麗，劉冬成

(1.廣西師范大學醫(yī)院藥劑科，廣西 桂林 541004； 2.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院健康管理中心，南寧 530201；3.廣西師范大學化學與藥學學院，廣西 桂林 541004)

癌癥由組織細胞惡性增生導致，其發(fā)病人數(shù)多，分布年齡廣泛，致死率高。據(jù)報告顯示，全球癌癥患者和死亡病例呈逐年增長趨勢，全球癌癥病例2012年為1 400萬，預計2025年遞增至1 900萬，2035年將達到2 400萬[1]。手術(shù)、放療、化療、免疫治療雖是現(xiàn)代癌癥治療的四大主要方案，但由于手術(shù)切除范圍的限制以及放療、化療的個體化敏感差異和嚴重的不良反應，腫瘤治愈率低、復發(fā)率高。因此，發(fā)現(xiàn)更多的藥物靶點，設計出能同時作用于多個靶點或通過聯(lián)合用藥進而提高腫瘤細胞敏感性的藥物，是提高腫瘤患者的響應率和實現(xiàn)腫瘤治療向慢性病治療轉(zhuǎn)變的難點。而腫瘤靶向治療和免疫治療因其高效、低毒、專一靶向性等特點，逐漸成為當今新型抗腫瘤藥物研究的熱點。

前列腺凋亡反應基因-4編碼的產(chǎn)物前列腺凋亡反應蛋白(prostate apoptosis response protein-4，Par-4)，首先在前列腺癌細胞中被發(fā)現(xiàn)，Par-4能夠選擇性地誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡而不影響正常細胞的生存和生長，因此成為近年腫瘤治療的新靶點。目前普遍認為，Par-4主要通過活化胱天蛋白酶(caspase)-3/9參與線粒體凋亡途徑[2-3]，并通過活化caspase-3/8參與經(jīng)典的Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)/caspase-3/8死亡受體凋亡途徑[4-5]共同誘導腫瘤細胞凋亡。Par-4具有優(yōu)良的抗腫瘤特性，所以研發(fā)機體內(nèi)提高Par-4水平的小分子促泌劑藥物成為新型抗腫瘤藥物研究的熱點。鉑類藥物的成功應用體現(xiàn)了金屬配合物藥物的巨大潛力。鉑類藥物雖然廣泛用于多種癌癥的化療，但仍受到不良反應嚴重、缺乏選擇性和耐藥性的限制[6]。因此，研究具有低毒性和高選擇性[7-8]的新型金屬化療劑成為抗腫瘤治療的新策略。現(xiàn)就近年有關(guān)提高Par-4水平的活性小分子的研究進展予以綜述。

1 Par-4概述

前列腺凋亡反應基因-4屬于前列腺雄激素調(diào)節(jié)基因家族成員，位于人第12號染色體長臂上，其編碼產(chǎn)物為Par-4。Par-4包含343個氨基酸，是一種亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域蛋白，分子量約為40 000，廣泛存在于不同類型的正常組織和癌細胞中[9]。內(nèi)源性Par-4本身不會引起細胞凋亡，但旁分泌過表達的外源性Par-4對誘導腫瘤細胞凋亡至關(guān)重要。

Par-4有一個對腫瘤細胞凋亡具有選擇性的結(jié)構(gòu)域，即選擇性腫瘤細胞凋亡誘導域(selective for apoptosis induction cancer cells domain，SAC)，由59個氨基酸組成，是Par-4發(fā)揮促凋亡作用不可或缺的功能性結(jié)構(gòu)域[10]。研究表明，只有SAC上的關(guān)鍵位點T163被蛋白激酶A磷酸化后才能誘導細胞凋亡[11]。雖然正常細胞中的SAC過表達[10]，但正常細胞內(nèi)的高內(nèi)源性蛋白激酶A水平顯著低于腫瘤細胞中蛋白激酶A水平，不能將T163磷酸化，所以滅活的SAC失去誘導健康正常細胞發(fā)生凋亡的能力[12]。

Par-4同時存在于細胞質(zhì)和細胞核中，但腫瘤細胞對Par-4的促凋亡具有抗性。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌和白血病等腫瘤細胞中，Par-4水平被下調(diào)超過70%，說明腫瘤對Par-4有抑制作用[9-10,13-14]。

2 Par-4促進腫瘤細胞凋亡的作用機制

目前普遍認為，Par-4主要通過胞內(nèi)凋亡通路和胞外旁分泌通路共同誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。同時，Par-4還可與許多細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白作用，促進腫瘤細胞凋亡，包括非典型蛋白激酶C、Wilm′s腫瘤基因1、死亡相關(guān)蛋白樣激酶/Zipper相互作用蛋白激酶，以及含有死亡相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白1、多巴胺D2受體和蛋白激酶B等[9,14-15]。

其中，內(nèi)源性Par-4通過激活胞內(nèi)凋亡通路及抑制胞內(nèi)存活路徑誘導腫瘤細胞凋亡。一方面，Par-4促進Fas/Fas配體轉(zhuǎn)移至細胞膜上，并進一步募集FADD[14,16]，吸引caspase-8酶原形成死亡誘導信號復合體，并特異切割caspase-8酶原成活性caspase-8，促使caspase大量活化誘發(fā)caspase級聯(lián)反應，進而引起細胞凋亡[17]。目前認為，這是Par-4最主要的誘導細胞凋亡途徑。過表達的Par-4不僅下調(diào)Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白的表達，還顯著增加了抑癌基因p53及其下游靶標p21的表達[18]。Par-4通過與Bcl-2啟動子上的WT1位點結(jié)合并下調(diào)Bcl-2翻譯，改變線粒體的膜電位，進而改變其通透性，引起鈣離子內(nèi)流，胞內(nèi)活性氧增加和活化caspase-3/9等，最終促進腫瘤細胞凋亡[2,19-20]。另一方面，Par-4在Asp-131處被caspase-3裂解，生成功能活性cl-Par-4，通過抑制蛋白激酶C活性和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)抑制蛋白激酶磷酸化，抑制NF-κB介導的細胞生存途徑，引起腫瘤細胞選擇性凋亡[21-22]；同時，Par-4的亮氨酸拉鏈通過抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的活性使得DNA不能解旋，從而影響基因復制和轉(zhuǎn)錄，最終誘導腫瘤細胞生存和發(fā)展[23]。

與內(nèi)源性Par-4誘導腫瘤細胞凋亡通路不同，當細胞外界條件發(fā)生改變(如缺氧、營養(yǎng)不足)時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能受到影響，大量未成熟的蛋白在其內(nèi)聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，Par-4通過經(jīng)典途徑被分泌到胞外。外源性Par-4的SAC與腫瘤細胞表面過表達的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 的N端特異性結(jié)合，引發(fā)FADD/caspase-8/caspase-3細胞凋亡通路，導致腫瘤細胞凋亡。而正常細胞表面的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78水平較低，不能被細胞外的Par-4識別，所以正常細胞能夠逃避旁分泌Par-4誘導的凋亡[9,14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，Par-4不僅在預防癌癥發(fā)展和復發(fā)方面發(fā)揮重要作用，還可以作為一種有前景的抗腫瘤治療劑[24]。

3 提高Par-4水平的活性小分子

研究表明，不同的藥物和蛋白質(zhì)、酶等小分子可調(diào)節(jié)Par-4水平，包括植物和微生物衍生物活性小分子以及人工合成的化合物分子等[9]。這些活性小分子通過結(jié)合細胞內(nèi)的波形蛋白，將Par-4從波形蛋白中置換出來，游離的Par-4能夠自發(fā)分泌至胞外，通過旁分泌通路引起腫瘤細胞凋亡，見圖1。

注：Par-4為前列腺凋亡反應蛋白-4

3.1來自植物或微生物的活性小分子 近年來，研究者相繼從植物中發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)Par-4表達能力的天然化合物。毒毛花苷是一種源自毒毛旋花的糖苷，最初作為心臟滲透劑使用。Huang等[25]將毒毛花苷用于前列腺癌細胞(PC-3細胞)，當Par-4的表達受到抑制或Par-4被敲除時，低劑量毒毛花苷的抗腫瘤細胞增殖作用降低，表明毒毛花苷治療前列腺癌是通過劑量依賴性方式增加Par-4的表達。

醉茄素A是天然植物睡茄的主要提取物之一，具有抑制多種腫瘤細胞生長的作用。2007年，Srinivasan等[26]首先描述了醉茄素A在PC-3細胞中的抗腫瘤活性及其作用機制。醉茄素A的促腫瘤細胞凋亡作用是通過誘導Par-4的分泌來抑制NF-κB和Bcl-2的表達，并激活caspase級聯(lián)反應。在醉茄素A對PC-3裸鼠移植瘤的抑瘤實驗中，與對照組相比，醉茄素A治療組顯示出顯著的腫瘤生長抑制和Par-4上調(diào)功能，其Par-4上調(diào)功能與叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box，F(xiàn)OX)O3a活性相關(guān)[9]。FOXO3a是由FOXO3基因編碼的人類蛋白質(zhì)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，又稱為腫瘤抑制器[27-28]。

MacLean等[29]發(fā)現(xiàn)了北美的蔓越莓提取物對幾種腫瘤細胞株的細胞周期和凋亡的影響。北美的蔓越莓提取物能促進Par-4上調(diào)，激活caspase-8和caspase-9，并促進腫瘤細胞凋亡。另一種從希臘中部和南部特有植物Onobrychis ebenoides中分離出的對人類癌細胞具有細胞毒作用的化合物Eb Ⅲ(Ebenfuran Ⅲ)也能影響Par-4的表達。Roumeliotis等[30]研究了Eb Ⅲ的細胞毒性作用及其在前列腺癌細胞(DU-145細胞)中的促腫瘤細胞凋亡作用機制。結(jié)果表明，藥物作用后體外細胞中的Par-4水平明顯升高，提示Par-4可能在Eb Ⅲ誘導DU-145細胞凋亡中起關(guān)鍵作用。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的植物多酚，是一類具有邁克爾受體結(jié)構(gòu)單元的重要天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、抗感染和抗腫瘤等藥理活性[31-33]。Thayyullathil等[34]研究證實，姜黃素可上調(diào)細胞內(nèi)Par-4水平，通過活性氧依賴的Par-4誘導觸發(fā)人類惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的自噬。同時姜黃素還是一種天然的β-二酮類配體，可與多種金屬螯合形成配合物。以姜黃素為配體合成的金屬鈀(Ⅱ)、鉑(Ⅱ)、釩(Ⅳ)和鈷(Ⅲ)等配合物具有較姜黃素更好的抗腫瘤活性[35-38]。但目前有關(guān)姜黃素類金屬配合物提高機體Par-4水平的報道較少。

另一些研究是通過轉(zhuǎn)基因植物來誘導必需治療分子的大規(guī)模生產(chǎn)。Sarkar等[39]于2015首先報道了轉(zhuǎn)基因煙草中Par-4的SAC-Par-4-綠色熒光蛋白在PC-3和MAT-LyLu前列腺癌細胞系中表現(xiàn)出細胞毒作用并能抑制NF-κB活性[40]。為延長Par-4壽命，進而提高Par-4的體內(nèi)性能，Kim等[41]使用適合大規(guī)模生產(chǎn)的大腸埃希菌表達系統(tǒng)開發(fā)出一種新型、持久的Par-4擴展序列Par-4Ex，并證明Par-4Ex完全保留了Par-4的促凋亡活性，但生物半衰期延長了約7倍；體內(nèi)實驗證實，由于生物半衰期延長，Par-4Ex蛋白在抑制小鼠轉(zhuǎn)移性腫瘤生長方面更有效。

3.2人工合成和半合成的活性小分子 在天然活性小分子的基礎(chǔ)上，研究者們合成和半合成了許多激活Par-4的化學小分子，它們具有較天然活性分子易獲取、產(chǎn)量高或穩(wěn)定性高等特點，也是潛在的抗腫瘤藥物。如Rossi等[42]評估了雷洛昔芬激活相關(guān)促腫瘤凋亡信號通路及體外腫瘤細胞中的Par-4水平發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷洛昔芬治療后，從前列腺癌細胞中提取的Par-4信使RNA和Par-4表達均明顯增加，且腫瘤細胞內(nèi)的caspase-3被顯著活化。

3-疊氮基醉茄素A是一種穩(wěn)定的半合成藥物，表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性。Rah等[43]發(fā)現(xiàn)經(jīng)3-疊氮基醉茄素A可誘導正常細胞通過經(jīng)典的旁分泌通路發(fā)生劑量依賴性的細胞外Par-4分泌。Rah等[44]發(fā)現(xiàn)，較低濃度的3-疊氮基醉茄素A能使PC-3和DU-145細胞自噬擴增，而在較高濃度的3-疊氮基醉茄素A中細胞自噬消失同時Par-4表達上調(diào)，腫瘤細胞凋亡增加，表明腫瘤細胞自噬向凋亡的轉(zhuǎn)換通過Par-4介導抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Beclin-1的活性實現(xiàn)。

噠嗪環(huán)稠合香豆素具有促進Par-4分泌的功能。Frasinyuka等[45]合成并研究了香豆素的衍生物6H-苯并吡喃[3,4-c]吡啶并[3′,2′:4,5]噻吩并[2,3-e]噠嗪-6-酮的抗腫瘤活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該衍生物可上調(diào)小鼠胚胎成纖維細胞中Par-4的水平，并降低PC-3和DU-145細胞的活力，從而誘導腫瘤細胞凋亡。

喹啉類化合物廣泛存在于各種天然和合成的產(chǎn)品中，包括一些重要的臨床使用的藥物和常見候選藥物[46-48]。喹啉衍生物具有多種生物活性，包括抗瘧疾、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等[49-50]。Sviripa等[51]通過熒光抗體標記Par-4，共聚焦顯微鏡跟蹤顯示，在正常細胞內(nèi)Par-4與波形蛋白結(jié)合，而3-芳基喹啉或芳基喹啉類藥物能取代Par-4與波形蛋白結(jié)合，刺激正常細胞大量分泌Par-4，這些外源性Par-4進入體循環(huán)，與腫瘤細胞表面過表達葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78受體結(jié)合，激活細胞凋亡通路，并通過抑制核內(nèi)NF-κB細胞存活通路和拓撲異構(gòu)酶I活性共同作用導致腫瘤細胞凋亡。

Burikhanov等[52]研究發(fā)現(xiàn)，抗瘧藥氯喹及其羥基酰化類似物可作為強效Par-4分泌誘導劑。氯喹刺激機體正常細胞大量分泌Par-4與抑癌基因p53及其轉(zhuǎn)錄靶點Rab8b有關(guān)，氯喹通過激活Par-4旁分泌促凋亡通路，有效地促進荷瘤小鼠和臨床癌癥患者的腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞中上皮向間充質(zhì)的轉(zhuǎn)變和侵襲。在一項關(guān)于腎細胞癌患者的臨床試驗中，氯喹還引起了Par-4的全身分泌[53]，故其有望作為抗腫瘤藥物進行進一步的研究和臨床試驗。

具有N雜環(huán)相鄰的甲酰基/乙酰基的喹啉骨架可以很容易地與帶有氨基的藥效團連接，得到席夫堿金屬配合物。通過以喹啉類化合物作為優(yōu)良配體，已經(jīng)報道合成了一系列具有抗腫瘤活性的喹啉類席夫堿銅(Ⅱ)配合物[54-57]。然而，作為潛在Par-4促泌劑的3-芳基喹啉及異喹啉類衍生物的金屬配合物研究較少。故通過對喹啉類金屬配合物結(jié)構(gòu)進行修飾與合成，有望獲得一系列新型Par-4促泌劑。

4 Par-4的聯(lián)合抗腫瘤治療

Par-4靶點的研究展現(xiàn)了它在抑制和治療結(jié)腸癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腎癌等腫瘤方面的巨大潛力[9]。Kline等[58]通過納米脂質(zhì)體傳遞Par-4質(zhì)粒，產(chǎn)生過表達的Par-4，實驗證明Par-4在體外和體內(nèi)均不同程度增加結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的反應，繼而降低腫瘤的生存力。在白血病細胞中，Par-4的激活不足以誘導細胞凋亡，但過表達的Par-4可增加細胞對誘導細胞凋亡藥物的敏感性[9]。因此推測，提高細胞內(nèi)Par-4水平可作為治療腫瘤的新策略。

Brasseur等[59]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過調(diào)控Par-4的活力及其定位，進而影響Par-4的表達。這種雌激素依賴性調(diào)節(jié)的發(fā)生，通過與DNA調(diào)控元件的直接結(jié)合和激素的抑制恢復Par-4的凋亡能力[60]。雌激素與Par-4呈負相關(guān)，且Par-4對激素非依賴性腫瘤細胞(如乳腺癌細胞MDA-MB-468)具有良好的殺傷力，故Par-4可作為婦科腫瘤治療的另一個靶點[14,61]。順鉑是常用的廣譜抗腫瘤藥物，但其易產(chǎn)生耐藥性。實驗證明，增加Par-4水平可以提高腫瘤對順鉑的敏感性和臨床療效[46]。Wang等[62]將Par-4與順鉑共同作用于腎母細胞瘤細胞SK-NEP-1發(fā)現(xiàn)，與單獨使用順鉑對比，順鉑聯(lián)合Par-4治療荷瘤小鼠體內(nèi)的腎母瘤細胞被大量誘導凋亡。因此，Par-4聯(lián)合順鉑治療方案可為未來腎母細胞瘤治療提供新思路。

5 小 結(jié)

Par-4是一種選擇性的腫瘤抑制蛋白，對正常細胞影響較小，其不僅具有選擇性誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的特性，還具有與其他抑癌因子相互協(xié)調(diào)的作用，具有巨大的腫瘤治療潛力。但目前關(guān)于Par-4促泌劑的研究較少，其中3-疊氮基醉茄素A、香豆素衍生物、喹啉和異喹啉類衍生物以及姜黃素衍生物等新型化合物均具有良好的抗腫瘤活性，同時能夠顯著上調(diào)Par-4水平。而通過過渡金屬與生物活性配體合成金屬配合物是開發(fā)抗腫瘤藥物的有效途徑之一，因此推測，將已知具有抗腫瘤活性、能提高Par-4水平的化合物作為母體進行結(jié)構(gòu)修飾和改造，或?qū)⑦@些化合物作為優(yōu)良配體與具有潛在抗腫瘤活性的金屬離子(鉑、銅、金、釕等)配位合成新型金屬配合物，有助于篩選出更多具有顯著提高Par-4水平的抗腫瘤藥物。