圍絕經期女性超重、胰島素抵抗與腸道菌群的相關性分析

盛吉蒞 諸劍芳 黃元安 金肖青

圍絕經期是女性卵巢功能及生育能力逐步走向衰退的時期，除潮熱、盜汗、睡眠障礙等癥狀外，大部分女性還會出現超重、肥胖以及胰島素抵抗的現象，進而增加2型糖尿病、高血壓等心血管和代謝性疾病的患病風險［1］。近年來，較多研究［2-3］發現腸道菌群與肥胖、胰島素抵抗關系密切，糾正失調的腸道細菌可能成為治療和預防肥胖的靶點。本文探討圍絕經期女性體重增加與相關血液指標和腸道菌群的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年12月至2019年12月本院圍絕經期患者72例。本項目通過醫院倫理委員會批準，患者均簽署書面知情同意書。納入標準［4］：①年齡＞40周歲，且＜60周歲；②出現月經周期不規則、經期時間延長、經量增多或減少，或月經停止1年內病史者。排除標準：①長期便秘或腹瀉；②存在胃腸道疾病，需長期服用胃腸動力藥物；③入組前3個月內曾服用益生菌或抗生素等藥物。體重指數（BMI）＜24.0為體重正常組（正常組，NC），24.0≤BMI＜28.0則為體重超重組（超重組，OB）。

1.2 方法 （1）形體指標：體重采用拜斯倍斯身高體重分析儀（型號：BSM370）于同一時間段進行測量；腰圍采用世界衛生組織（WHO）推薦的測量腰圍的方法［5］，雙腳分開25～30 cm，測量位置在水平髂前上嵴和第12肋下緣連線的中點，反復測量3次，取平均數；臀圍測量時兩腿并攏直立，測量位置在恥骨聯合和背后臀大肌最凸處。腰臀比（WHR）=腰圍（cm）/臀圍（cm）；腰圍身高比（WHtR）=腰圍（cm）/身高（cm）。（2）血液指標：抽取肘靜脈血，檢測患者血液中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、空腹胰島素（FINS）及空腹血糖（FPG），并計算（胰島素抵抗指數）HOMA-IR。（HOMA-IR）= 空腹血糖（FPG）×空腹胰島素（FINS）/22.5。（3）腸道菌群檢測方法：①樣品采集：用一次性采樣勺采集新鮮排出的糞便≥2 g，裝入無菌糞盒中，并將樣本凍存于-80℃冰箱中。②預處理：1 g糞便樣品用30 mL無菌的0.1 mmol/L磷酸鈉緩沖液（SPB）懸浮，渦旋約30 min，200 g離心5 min，離心3次，去除粗顆粒，收集上清液；9,000 g離心3 min，收集沉淀，30 mL SPB洗4次，最后重懸于10 mL的SPB中，平均分裝成5份，置于-70℃保存，用于后續DNA提取。③DNA提取、純化及檢測：依據糞便腸道菌群DNA 提取試劑盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（QIAGEN）操作說明書進行樣本DNA 提取。操作步驟如下：用紫外分光光度計（NanoDrop）檢測DNA濃度及純度，1% 瓊脂糖凝膠電泳跑膠觀察DNA完整性。選取OD260 /OD280值在1.8～2.0之間、條帶完整的DNA樣本進行后續分析。④PCR擴增、建庫及測序：采用細V3-V4區通用引物對16S rDNA進行PCR擴增。所用引物為341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。使用Thermofisher公司的Ion PlusFragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的庫經過Qubit定量和文庫檢測合栺后，使用IonS5TMXL測序儀上機測序。⑤數據分析：使用Cutadapt進行剪切、拆分和處理得到原始序列（Rawreads），并利用UCHIME Algorithm與物種注釋數據庫迚行比對檢測，得到最終的有效數據（Clean Reads）。采用Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，默認以97%的一致性（identity）將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic Units，OUT），同時選取OTU數目的代表性進行物種注釋。使用Qiime軟件計算Chao1，Shannon和Simpson指數，使用R軟件進行組間差異分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件。符合正態分布計量資料以（±s）表示，用t檢驗；不符合正態分布，用秩和檢驗；計數資料采用頻數表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 見表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

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2.2 血液指標比較 與正常組比較，超重組的空腹胰島素和HOMA-IR水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組血液指標比較（±s）

表2 兩組血液指標比較（±s）

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2.3 兩組腸道微生物多樣性比較 兩組Observedotus，Chao1，Shannon，Simpson，ACE指數，比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組腸道微生物多樣性比較（±s）

表3 兩組腸道微生物多樣性比較（±s）

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2.4 兩組腸道菌群相對豐度比較 在門水平上，正常組菌群相對豐度較高的依次為厚壁菌門（Firmicutes）84.5%，擬桿菌門（Bacteroidetes）11.71%，放線菌門（Actinobacteria）3.62%，變形菌門（Proteobacteria）1.07%，梭桿菌門（Fusobacteria）0.01%，超重組的菌群相對豐度較高的依次為厚壁菌門（Firmicutes）79.61%，擬桿菌門（Bacteroidetes）11.73%，變形菌門（Proteobacteria）4.22%，放線菌門（Actinobacteria）3.65%，梭桿菌門（Fusobacteria）0.54%。超重組菌群相對豐度與正常組比較差異無統計學（P＞0.05），見圖1。

圖1 兩組腸道菌群相對豐度比較

2.5 兩組腸道菌群差異物種分析 超重組的δ變形菌綱（deltaproteobacteria）、脫硫弧菌目和脫硫弧菌科（desulfovibrionaceae）與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2～4。

圖2 T-test檢測方法在綱水平上兩組腸道菌群的差異

圖3 T-test檢測方法在目水平上兩組腸道菌群的差異

圖4 T-test檢測方法在科水平上兩組腸道菌群的差異

3 討論

腸道菌群作為人體最大的微生態系統，是近來與肥胖相關的多種疾病防治研究的熱點之一。腸道菌群的改變可引發慢性炎癥反應，進而導致肥胖、胰島素抵抗等代謝失調。本資料顯示，超重組女性腸道菌群豐度及多樣性結果與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但超重組菌群豐度及多樣性呈下降趨勢。在腸道菌群組成結構方面，兩組菌群結構大體相當，在門水平中，兩組均以厚壁菌門和擬桿菌門為優勢菌群，這與相關研究［6］結果一致。

本資料中，超重組甘油三酯、總膽固醇、LDL水平總體較高，HDL和空腹血糖水平較低與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而空腹胰島素水平、HOMA-IR以及腸道菌群中δ-變形菌和脫硫弧菌數量增高（P＜0.01），表明圍絕經期女性體重增加過程中，胰島素抵抗出現早于糖脂代謝紊亂，且該過程可能與腸道菌群中δ-變形菌和脫硫弧菌的數量改變有關。變形菌門是腸道微生物中最大的一門，包括α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌、δ-變形菌和ε-變形菌等五類，其中有較多致病菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌和幽門螺桿菌等，會導致胃腸道感染、傷寒、霍亂、急慢性胃炎等疾病，變形菌門比例增高被認為是腸道菌群失調的微生物標志之一［7-9］。

目前關于肥胖的病理生理機制尚不清楚，但近年來研究［10］揭示，肥胖與慢性低度炎癥有關，且慢性低度炎癥被認為是促使肥胖患者胰島素抵抗進一步發展的使動因素之一。脫硫弧菌屬于δ-變形菌綱中最主要的一種可以產生硫化氫的細菌，其能夠促進腸道IL-6和IL-8的分泌，誘發腸道慢性炎癥［11-12］，進而促進體重增加及胰島素抵抗的發展。另外，腹部脂肪增加也是胰島素抵抗的一個重要原因。本資料結果顯示，圍絕經期女性體重增加的同時腰圍、WHtR也增大（P＜0.01）。有研究表明［13-15］腹部脂肪增加會導致脂肪細胞分泌的游離脂肪酸（FFA）、瘦素（Leptin）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、抵抗素（Resistin）、脂聯素（Adiponectin）、過氧化物酶體增殖體激活物受體γ（PPAR-γ）等物質也相應增加，使局部組織對胰島素的敏感性下降，從而影響胰島素的效應發揮，導致胰島素抵抗的產生。

綜上所述，圍絕經期女性超重及胰島素抵抗的發展可能與腸道菌群的結構改變存在一定關系。但本研究也有一定的局限性，比如未納入肥胖的圍絕經期女性，且腸道菌群結構受飲食習慣、地域等多方面影響，結果難免產生一定的偏倚，期待后續研究能將以上因素納入考慮，進一步探索圍絕經期女性體重增加與腸道菌群的相互關系。