蝮蛇咬傷患者程序性死亡因子-1和T淋巴細胞亞群的表達與病情嚴重程度的相關性分析

姚洪鋒 呂彩萍 郭瑜佳 陳文泱 駱方軍 何玉領

我國每年蛇咬傷患者10～30萬人次，有較高的致殘率及致死性［1］。本地區地理環境適宜蛇類生長，尤以蝮蛇居多，每年發生蛇咬傷患者較多。蝮蛇咬傷后主要是蛇毒毒素或酶激活炎癥細胞，釋放炎癥介質并引起過度炎癥反應，引起機體損傷，炎癥因子C反應蛋白（CRP）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）等明顯升高［2］。過度的炎癥反應引起機體生理、病理變化的同時，也影響機體的免疫平衡。目前關于蝮蛇咬傷患者免疫狀態變化及相應機制的報道較少，但在類似的中毒反應時可見淋巴細胞功能異常［3］。程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）作為免疫調控抑制因子，在感染、炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發揮重要作用［4］。但在蝮蛇咬傷患者中PD-1的表達及與嚴重程度變化尚不清楚，本文探討蝮蛇咬傷患者T淋巴細胞亞群、PD-1的表達變化及在評估病情嚴重程度與預后中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年3月至2019年8月本院蝮蛇咬傷患者106例，根據《2018年中國蛇傷救治專家共識》［5］蛇咬傷嚴重度評分表分為輕度蝮蛇咬傷組75例與中、重度蝮蛇咬傷組31例；其中中、重度組中有23例患者經治療康復后14 d隨訪復查。另選取同期本院體檢中心健康體檢者30例作為健康對照組。三組受試者性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。（1）納入標準：①符合《2018年中國蛇傷救治專家共識》診斷標準，明確為蝮蛇咬傷，常規予以清創局封、季德勝蛇藥及抗蝮蛇毒血清治療；②在蛇咬傷后12 h內入院；③未在外院就診，包括使用抗蛇毒血清等。（2）排除標準：①有自身免疫性疾病、細菌性感染、病毒性感染及其它可引起炎癥的基礎疾病；②合并有多器官功能障礙、昏迷、嚴重心、肝、腎、血液等系統疾病以及精神疾病。本項目經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）標本采集：蝮蛇咬傷患者于入院時直接采集2支2 mL EDTA抗凝血，其中1支立即3,500 r/min，離心10 min分離血漿并保存于-70℃冰箱內，用于CRP、SAA、IL-6、IL-10、TNF-α檢測；另1支EDTA抗凝血立即完成T淋巴細胞亞群與PD-1分析。隨訪患者于隨訪當日空腹采集2支2 mL EDTA抗凝血。（2）血清CRP、淀粉樣蛋白A（SAA）檢測：均采用膠乳增強免疫比濁法檢測，根據試劑說明書要求設置檢測參數；儀器為日立7600全自動生化分析儀，試劑：SAA為浙江愛康生物科技有限公司；CRP為安徽伊普諾康生物技術股份有限公司。（2）IL-10、IL-6、TNF-α：采用流式熒光法檢測，按試劑說明書要求檢測，儀器為BD Canto II，使用Diva軟件進行結果分析。試劑：江西諾德醫療器械有限公司的人Th1/Th2亞群檢測試劑盒。（4）CD3+、CD4+、CD8+：采用流式細胞術檢測，儀器：BD Canto II，試劑：BD 貨號。將全血50μL和抗體試劑20μL加入到BD管中，混勻后室溫靜置孵育15 min，加入500μL溶血劑，震蕩混勻后靜置5 min，上機檢測。使用BD Canto軟件進行數據采集與分析。（5）PD-1檢測：將獲得的外周血單個核細胞懸液以1×106/μL分裝于試管中，在單克隆抗體（20μL）和熒光素的共同作用下室溫培養20 min。檢測T淋巴細胞CD4+、CD8+細胞上CD279+表達量即為PD-1水平。所使用的CD3/CD4/CD8/CD279熒光單克隆抗體及其同型對照均購自美國BD Biosciences公司。加入500μL溶血劑，震蕩混勻并靜置5min，然后，細胞在1,500 r/min下離心5 min，用美國BD公司的 FACS CantoII流式細胞儀分析，BD FACS Diva 軟件進行數據采集與分析。

1.3 統計學分析 采用 SPSS19.0統計軟件。符合正態分布的計量資料用（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蝮蛇咬傷患者一般資料 見表1。

表1 蝮蛇咬傷患者一般資料

2.2 炎癥因子、T淋巴細胞亞群及PD-1結果分析 見表2、圖1。

表2 蝮蛇咬傷患者免疫功能分析（±s）

表2 蝮蛇咬傷患者免疫功能分析（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與輕度組比較，#P＜0.05

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2.3 各指標水平與蝮蛇咬傷患者SSS評分的相關性 CD4+/CD8+比值與蝮蛇咬傷嚴重程度呈負相關，CRP、SAA、IL-6、TNF-α、IL-10、CD4+PD-1+均 與蝮蛇咬傷嚴重程度呈正相關（P＜0.05），見表3。

表3 各指標水平與腹蛇咬傷SSS評分相關性分析

3 討論

蝮蛇咬傷，主要表現為皮下出血、瘀斑，咬傷部位腫脹、疼痛，造成細胞破壞、組織壞死，肢體殘廢，嚴重者出現心功能不全、神經系統損傷、全身炎癥反應綜合征（SIRS）甚至多器官功能障礙綜合征（MODS）［6］。其中IL-6、TNF-α等炎性細胞因子釋放增加，且可用于臨床嚴重程度及療效評估［7］，這與本資料結果一致。SANTHOSH等［8］發現通過毒蛇毒液誘導的細胞實驗中，IL-6、TNF-α水平均升高，同時，氧化應激及炎癥反應明顯增強；在藏紅花預處理后的實驗組中，可見IL-6、TNF-α水平降低，氧化應激及炎癥反應減弱。

在正常生理條件下，CD4+T細胞與CD8+T細胞的比例處于動態平衡，而在外界刺激下，CD4+/CD8+的平衡被打破，導致機體免疫內環境紊亂。本資料結果顯示，蝮蛇咬傷患者CD4+T細胞百分數降低，CD8+T細胞百分數升高，且 CD4+/CD8+比值與病情嚴重程度呈負相關，這可能是蝮蛇蛇毒毒素引起T淋巴細胞免疫調節失衡，進一步引起機體的免疫狀況和炎癥的進展。周克兵等［9］發現蛇咬傷后的炎癥變化與患者的免疫功能下降有關，當重癥蝮蛇咬傷患者經烏司他丁治療后隨著癥狀的改善CD4+和CD8+T細胞表達水平逐漸升高，其中以CD4+T細胞尤為明顯，同時細胞因子IL-6和TNF-α水平明顯降低，這與本資料中觀察到的變化情況一致，提示在蝮蛇咬傷時隨著病情的好轉，T淋巴細胞免疫平衡逐漸恢復，炎癥減輕。類似的中毒引起淋巴細胞亞群變化的可見氯化氫氣體、甲胺磷農藥中毒患者，CD4+表達量與中毒嚴重程度、炎癥反應程度正相關，致使機體免疫功能紊亂。

在免疫調節過程中，PD-1同樣起重要作用。本資料顯示，CD4+PD-1+在中重度蝮蛇咬傷患者中呈高表達，且與病情嚴重程度呈正相關；經治療后CD4+PD-1+表達明顯降低，同時炎癥因子水平明顯降低，CD4+T細胞表達明顯升高，可能為PD-1通過調節免疫平衡，抑制炎癥反應。PD-1其主要表達于T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞等，且在活化的T淋巴細胞表面、樹突狀細胞（DC）和單核細胞中表達上調，具有調節活化和效應期淋巴細胞的功能，在抗炎、抗腫瘤過程中發揮重要作用。HIRAHARA等［10］發現在系統性紅斑狼瘡中，疾病活動度高的患者有更高的PD-1水平，且隨著治療好轉，PD-1水平逐漸降低，提示PD-1可作為SLE疾病活動度的標志物。在膿毒血癥患者外周血記憶性CD4+T淋巴細胞中存在高表達的PD-1水平，說明在炎癥過程中存在免疫抑制的現象［11］。韓輝等［12］發現Grave's病患者外周血CD4+、CD8+細胞中PD-1表達升高，促進甲狀腺濾泡上皮細胞活性，導致炎性細胞因子水平升高，加速GD的發生和發展。在惡性膠質瘤中，PD-L1表達上調，促使CD4+、CD8+T細胞增加，并加重了炎癥反應［13］。賈煒煒等［14］在肝包蟲病合并HBV感染患者中證實了CD4+PD-1+的表達與肝功能損傷程度密切相關，說明PD-1對T細胞的調節具有重要意義。在SIV病毒感染的動物模型中，促炎細胞因子TNF-α，IL-6顯著增加，PD-1在肺泡巨噬細胞（AM）上表達明顯增加，并與血漿病毒載量有明顯的相關性，表明PD-1表達通過調節AM的功能活性，參與疾病進展［15］。

綜上所述，蝮蛇咬傷后機體存在T淋巴細胞調節失衡并伴有細胞因子分泌紊亂，且與病情嚴重程度相關。PD-1表達與病情嚴重程度相關，提示PD-1可能參與蝮蛇咬傷后機體免疫功能變化，這可為蝮蛇咬傷患者的進一步診治提供了新的思路。