2個攜帶線粒體12S rRNA A1555G和tRNAThr突變的聾病家系分析

王歡 張雨霖 許育絢 丁禹

耳聾是一種常見的疾病，嚴重困擾人類的生活。有研究顯示，每1,000個新生兒中有1～3例聽力障礙，且約30%成年人在＞65歲出現明顯的聽力下降［1-2］。遺傳因素和環境因素均可以引起聽力下降，其中約50%耳聾由遺傳因素引起［3］，遺傳方式可表現為常染色體顯性、常染色體隱性、X-連鎖和母系遺傳等［4］。母系遺傳中，線粒體12S rRNA基因是氨基糖甙類抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn）導致的非綜合征型聽力損失的一個突變熱點區域。其中，位于12S rRNA高度保守解碼區的A1555G和C1494T突變與耳聾相關，可導致較多患者對AmAn敏感［5］。除了12S rRNA基因外，線粒體tRNA（mitochondrial tRNA，mt-tRNA）也是耳聾相關的突變熱點區域，近年來有研究發現，tRNASer（UCN）A7445G［6］，tRNAIle A4317G［7］，tRNAThrG15927A［8］突變和耳聾有關。本研究分析2個攜帶線粒體12S rRNA A1555G突變的聾病家系，并對其做了臨床和分子遺傳學的評估。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本課題組前期收集耳聾患者213例，其中男108例，女105例；年齡21～76歲，中位年齡45歲。正常對照120例，其中男66例，女54例，年齡19～55歲，中位年齡39歲。本項目經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 線粒體12S rRNAA1555G突變篩查 將患者樣本統一編號，數據錄入后提取基因組DNA。使用大連寶生物有限公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 4.0試劑盒提取基因組DNA，并進行濃度和純度的鑒定。對有些低濃度、純度的樣本在1.5%瓊脂糖凝膠（EB濃度為0.5 μg/mL）上電泳，進一步驗證基因組DNA是否提取成功。使用以下引物擴增12S rRNA基因：正向：5'-CGATCAACCTCACCACCTCT-3'；反向：5'-TGGACAACCAGCTATCACCA-3'，PCR后取5 μL的產物進行電泳分析，并對PCR擴增產物純化，送華大基因測序，測序結果用DNAstar和Chromas 2.0軟件與校正后的人類線粒體劍橋參考序列（revised Cambridge Reference Sequence，rCRS，GenBank Accession Number：NC_012920.1）［9］比對，讀取12S rRNA變異結果。

1.3 2個攜帶線粒體A1555G突變的家系分析 經過詳細的遺傳咨詢，鑒定了2個母系遺傳的耳聾家系（SXD-10；SXD-15），見圖1。耳聾患者經過紹興市柯橋區婦幼保健院耳鼻喉科門診的詳細病史調查和體格檢查，以確定是否有綜合征性耳聾的臨床表現，是否有AmAn的使用史以及是否有其他致聾的環境因素。其中聽力學檢查包括純音測聽（pure tone audiometry，PTA）、聽覺腦干反應（auditory brainstem response，ABR）、聲阻抗以及畸變產物耳聲發射（distortion product otoacoustic，DPOAE），純音測聽以聽力水平的分貝（dB）值為單位進行測量，并以頻率500、1,000、2,000、4,000、8,000 Hz的聽閾平均值計算，將聽力損失的嚴重程度分成5級，正常＜25 dB，輕度聾25～40 dB，中度聾＞ 40～60 dB，重度聾＞60～90 dB，極重度聾＞90 dB［10］。

圖1 2個攜帶線粒體A1555G突變的聾病家系，箭頭所指的是先證者

1.4 線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變篩查 對2個家系的母系成員（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）進行基因組DNA提取，使用24對引物進行線粒體基因組的PCR擴增［11］。對全部PCR產物進行純化、測序，將測序結果和rCRS比對，判斷變異位點。

1.5GJB2基因突變篩查 使用正向引物：5'-TATGACACTCCCCAGCACAG-3'；反 向 引 物：5'-GGGCAATGCTTAAACTGGC-3'對母系成員（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）進行GJB2基因的PCR擴增，擴增產物經過純化后送至華大基因測序，測序結果與GJB2基因的標準序列［12］進行比對，篩選突變位點（GenBank Accession Number：M86849）。

2 結果

2.1 線粒體A1555G突變篩查 對213例耳聾患者和120例正常對照個體進行線粒體A1555G突變篩查。首先擴增線粒體12S rRNA基因，隨后進行Sanger測序分析，共鑒定了2個攜帶A1555G突變的個體，但該突變在正常對照個體中未被發現。經過對先證者詳細的遺傳咨詢后，發現這2個家系具有較為明顯的母系遺傳。見圖2。

圖2 線粒體A1555G突變鑒定：A. 線粒體12S rRNA基因PCR擴增電泳圖；B. 線粒體A1555G突變測序鑒定

2.2 2個攜帶線粒體A1555G突變家系的臨床資料 這2個家系主要生活在紹興市柯橋區，在SXD-10家系中，先證者（II-8），女，61歲，從小有AmAn的用藥史，劑量不明。用藥后雙耳聽力下降，純音測聽，聲阻抗，ABR等臨床檢測提示雙側極重度耳聾，其中右耳的PTA為90 dB，左耳的PTA為80 dB。先證者的2個弟弟（II-3和II-5）也有不同程度的聽力損失，其中II-3還有AmAn的用藥史。先證者的兒子（III-5）也是耳聾患者，右耳的PTA為55 dB，左耳的PTA為75 dB。該家系共3代15人，母系成員共6人，患病人數4人，耳聾的外顯率為66.7%。其他成員聽力正常，無糖尿病、心血管疾病、視覺障礙等其他疾病。在SXD-15家系中，先證者（III-9），女，35歲，聽力檢測提示右耳和左耳的PTA均為80 dB，屬于重度耳聾。經過詳細的遺傳咨詢，發現先證者的哥哥（III-6），母親（II-6），姨媽（II-4）和外婆（I-2）均為耳聾患者，其中II-4和II-6有AmAn的用藥史，用藥劑量不詳。該家系共4代21人，母系成員8人，患病數5人，耳聾的外顯率為62.5%。家系的其他成員聽力正常，無糖尿病、心血管疾病、視覺障礙等其他疾病，見表1。

表1 兩個攜帶線粒體A1555G突變的耳聾家系母系成員臨床資料

2.3 線粒體基因組的突變分析 對這2個家系的母系成員（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）的線粒體基因組進行PCR擴增并進行測序分析，見表2。發現在D-Loop區含有14個變異位點，在12S rRNA上有5個突變位點，16S rRNA上有3個突變位點，在tRNAThr上有2個突變位點（A15924G和G15927A），其余的突變主要集中在蛋白編碼區，其中錯義突變共有7個：ND2 C5178A（Leu→Met）和A5301G（Ile→Val），A8 C8414T（Leu→Phe），A6 A8701G（Thr→Ala）和A8860G（Thr→Ala），ND5 G13708A（Ala→Thr），CytB A15326G（Thr→Ala）。隨后對這些變異位點在不同物種間（包括人、牛［13］、鼠［14］、爪蟾［15］）的mtDNA進行種系進化保守分析，除12S rRNA A1555G，tRNAThrA15924G和G15927A突變外，其余突變在進化上均不保守。

表2 兩個攜帶A1555G突變的耳聾家系母系成員線粒體基因變異匯總表

2.4GJB2基因突變篩查GJB2是導致遺傳性非綜合征型耳聾最常見的基因［16］。對這2個家系的母系成員（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）進行GJB2基因突變篩查，在這兩個家系中并未發現GJB2基因的突變位點，提示GJB2在耳聾的表型表達中并不起作用。

3 討論

本研究首先對213例耳聾患者和120例正常對照個體進行線粒體A1555G突變的篩查，經過測序分析發現有2個耳聾患者攜帶A1555G突變。當發生A1555G突變時，線粒體核糖體A位形成了一個新的1494C-G1555堿基配對，使得12S rRNA基因在二級結構上與E.coil16S rRNA相應解碼區更加相似，從而增強AmAn藥物在12S rRNAA位的結合力［17］。轉線粒體細胞系生化功能研究發現：A1555G突變可以導致線粒體功能障礙，且對AmAn具有超敏性［18］。在無AmAn存在時，攜帶A1555G突變的家系母系成員在外顯率、聽力損失程度和發病年齡方面存在較大差異，表明A1555G突變本身尚不足以造成耳聾，其他修飾因子如AmAn、線粒體單倍型和核修飾基因等可能參與調節耳聾的外顯率和表型表達［19］。

對2個攜帶A1555G突變的耳聾家系進行分析后發現，這2個家系中患者僅表現為聽力障礙單一的臨床癥狀，且呈現典型的母系遺傳特征，提示耳聾的發病與mtDNA突變有關。對先證者和母系成員的線粒體基因組突變分析后發現，存在A1555G突變和tRNAThr突變（A15924G和G15927A），分別屬于東亞線粒體單體型B4c1和B5b1［20］。從結構上看（見圖3），A15924G和G15927A突變均發生在tRNAThr的反密碼子環上，其中A15924G突變破壞了原有的（29T-37A）Watson-Crick堿基配對，而G15927A突變破壞了原有高度保守的（26C-40G）的堿基配對。A15924G突變被報道和線粒體腦肌病有關［21-22］，而G15927A突變被報道和冠心病［23］、Leber視神經病變有關［24］。轉線粒體細胞功能學研究發現：G15927A突變顯著降低tRNAThr的穩定性和氨基酰化水平［25］。因此，線粒體A15924G和G15927A突變通過改變tRNAThr的二級結構，進而導致tRNA代謝紊亂，使得線粒體蛋白合成受阻，加劇A1555G突變引起的線粒體功能障礙，是耳聾有關的繼發性突變位點。由于并未篩查到GJB2基因任何有意義的突變位點。因此，在這2個家系中，線粒體tRNAThrA15924G和G15927A突變可能是影響耳聾表型表達的重要因素。對有耳聾家族史的個體，早期篩查mtDNA突變是有必要的，這為降低耳聾的發病率，預防藥物性耳聾具有重要的臨床意義。

圖3 線粒體A15924G和G15927A突變所在的tRNAThr基因的二級結構圖，箭頭所指的是A15924G和G15927A突變的位置