雷公藤多苷通過線粒體自噬-NLRP3通路干預潰瘍性結腸炎的機制分析

吳佩 吳佳倩 羅依婷 鐘繼紅 劉英超

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要累及直腸和結腸的黏膜及黏膜下層，表現為反復腹痛、腹瀉、黏液膿血便等［1］。黏膜免疫應答紊亂、基因易感性、腸道菌群失衡等多種因素導致UC的發生、發展［2-3］。據報道，UC的發病與NLRP3炎癥小體有密切關系［4-5］，且線粒體自噬在NLRP3炎癥小體的產生激活過程中起關鍵作用［6-7］。雷公藤多苷是一種從雷公藤植株中提取的五環三帖類化合物，臨床上可用于治療潰瘍性結腸炎和克羅恩病［8］。其中雷公藤紅素是雷公藤多苷中抑制免疫和抗炎作用的最重要成分［8-10］，本研究旨在探討雷公藤多苷治療潰瘍性結腸炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性BALB/C小鼠24只，體質量22～24 g，由浙江中醫藥大學動物中心提供，動物生產許可證SCXK（上海）2013-0016。實驗嚴格遵循浙江中醫藥大學動物保護與使用委員會的倫理規定和“實驗動物保護與使用指南”。動物飼養在溫度為23±2℃，濕度為55%±10%的無特定病原體的環境中，光照/黑暗周期為12 h，并使用標準的實驗室飼料和水。

1.2 細胞 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）由浙江中醫藥大學實驗室提供，以含10%胎牛血清、10萬U/L青鏈霉素的DMEM培養液培養，置于含5%CO2、37℃培養箱中。根據細胞生長情況換液，1次/12～24 h，細胞生長至70%～80%融合后，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液進行傳代培養，2～3 d傳代1次。

1.3 藥物、試劑和抗體 雷公藤多苷購自浙江得恩德制藥有限公司，雷公藤紅素（LOT：P26A9F600105）購自上海源葉生物科技有限公司。葡聚糖硫酸鈉（DSS，MW；36～50 kDa；LOT NO：S0948）購自Sigma-Aldrich公司。PINK1 Antibody、Nur77 Antibody購自上海優寧維生物科技股份有限公司。

1.4 動物分組和干預 適應性飼養2周后，將小鼠隨機分為對照組、UC組、雷公藤多苷藥物組，給予UC組及藥物組小鼠3%DSS溶于水的溶液連續自由飲用7 d構建UC模型，同時給予對照組小鼠等量蒸餾水自由飲用。造模7 d后給予藥物組小鼠雷公藤多苷溶液灌胃，同時給予其他小鼠等量蒸餾水灌胃。每天觀察記錄小鼠體重、毛色、精神狀態、糞便性狀及顏色等，14 d后處死所有老鼠，取各組病變最嚴重的結腸組織進行肉眼及組織學檢查。

1.5 細胞分組和干預 將RAW264.7細胞設定對照組、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）組、雷公藤紅素藥物組，向LPS組及藥物組細胞中加入含終濃度為100 ng/mL LPS的DMEM培養液100 μL，同時向藥物組細胞中加入含終濃度為0.062,5 μmol/L雷公藤紅素的DMEM培養液100 μL。分別培養24 h后，取細胞培養液，提取細胞蛋白并定量、變性進行分析。

1.6 造模及組織學觀察 從造模第1天開始，觀察小鼠體重變化、糞便性狀以及是否便血，計算疾病活動指數（DAI）。造模是否成功取決于大便稀爛程度、是否便血、有無體質量減輕和形態學改變。選取肉眼觀病變明顯的結腸用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4 μm厚，切片蘇木精-伊紅（HE）染色。評估組織學評分。

1.7 NLRP3的mRNA測定 實時定量PCR檢測NLRP3mRNA表達。取細胞培養上清液，用紫外分光光度法測定RNA的含量和純度，分離后分析溶解度曲線，然后用SuperScript III First-Strand合成SuperMix進行qRT-PCR，用SYBR Green PCR Master Mix進行RTPCR Power。采用2-ΔΔCT法測定表達水平。

1.8 Western blotting分析 提取細胞總蛋白后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉（中國上海華比生命科學公司）室溫封閉2 h后，與一抗（PINK1 Antibody、Nur77 Antibody）在4℃孵育過夜。隨后，膜與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的抗鼠或抗兔免疫球蛋白G（IgG）在室溫下孵育1 h。通過化學發光增強的HRP底物（微孔）顯示該蛋白，并使用Image J軟件（NIH）進行定量。

1.9 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料用（±s）表示，計數資料用%表示；多組間比較方差齊性時采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；多組間比較方差不齊時采用Kruskal-wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤多苷治療UC小鼠體質量、病理變化 采用3%DSS溶液連續7 d喂養小鼠建立模型，UC組和雷公藤多苷藥物組小鼠從第6天開始出現體重減輕、腹瀉、便血等癥狀，UC組小鼠同時出現弓背、活動減少等表現。與UC組比較，雷公藤多苷藥物組小鼠上述癥狀均減輕。結腸組織觀察發現，UC組肉眼可見明顯結腸萎縮，鏡下上皮隱窩丟失，組織間中性粒細胞大量浸潤，表皮潰瘍等表現。雷公藤多苷藥物組結腸未見萎縮，黏膜平整光滑無出血，未見糜爛和潰瘍，鏡下僅少量炎性細胞浸潤。藥物組小鼠DAI評分和組織學評分低于UC組（P＜0.05）。見圖1及表1。

圖1 各組光鏡下病理改變

表1 不同組體重下降率、DAI和組織學評分比較（±s）

表1 不同組體重下降率、DAI和組織學評分比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與UC組比較，#P＜0.05

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2.2 雷公藤紅素對細胞NLRP3 mRNA表達的影響 在RAW264.7細胞中加入100 ng/L的LPS構建炎癥模型，并使用0.062,5 μmol/L的雷公藤紅素干預。采取PCR法檢測各組細胞炎癥因子NLRP3的mRNA表達量，結果表明：LPS造模后NLRP3 mRNA相對表達量高于對照組（P＜0.05），而雷公藤多苷藥物組干預后表達量有明顯恢復，但仍高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 不同組細胞NLRP3 mRNA相對表達量比較

2.3 雷公藤紅素對細胞線粒體自噬蛋白表達的影響 細胞實驗最后階段收集各組細胞，提取細胞總蛋白，采取Western blotting法檢測各組細胞線粒體自噬相關蛋白PINK1、Nur77表達量，結果表明：LPS造模后PINK1、Nur77蛋白表達量顯著高于對照組（P＜0.05），而藥物干預組蛋白表達量較LPS組下降（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同組之間WB法檢測細胞線粒體自噬蛋白表達量比較

3 討論

近年來，亞洲地區UC的發病率呈明顯上升趨勢［11］，目前UC的治療仍以美沙拉嗪及免疫抑制劑為主［12］，但存在一定的不良反應以及停藥后的復發問題。雷公藤多苷作為中草藥提取藥物，臨床療效明確。雷公藤多苷能抑制炎癥反應，促進受損黏膜愈合，并對黏膜纖維化具有一定的抑制作用，但其作用機制仍不十分明確。

雷公藤多苷化學成分包含各種二萜、三萜、生物堿以及其它成分如有機酸、木質素、多糖等。其中三萜類化合物具有廣泛的生物活性，其代表性化合物有雷公藤紅素、雷公藤內酯甲、雷公藤內酯乙等［13］。有研究表明，雷公藤紅素參與多種炎癥信號通路的調控，如阻斷NF-κB激活酶的活性，抑制NF-κB的活化及其核轉位，調節絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，是雷公藤多苷中主要抗炎成分［14］。本次實驗發現，雷公藤多苷能明顯改善UC小鼠癥狀以及結腸的病理，進一步驗證雷公藤多苷對UC小鼠的療效。大量研究［15-16］表明，UC患者腸黏膜中存在多種促炎因子，而這些炎癥因子與NLRP3炎癥小體的活化密切相關，NLRP3炎癥小體過度激活及IL-1β、IL-18過度釋放在UC慢性病程的遷延中起重要作用，而由線粒體產生的ROS與UC發病過程中NLRP3炎癥小體的激活有密切關系［17］。作者在前期實驗也發現，雷公藤多苷可以通過抑制ROSNLRP3信號通路進而發揮抑制UC小鼠炎癥的發生。

雷公藤紅素作為雷公藤多苷重要的化合物，具有較強的免疫抑制和抗炎作用，其可以通過調節內源性ROS的信號通路，調節幾種關鍵分子分泌而抑制細胞分化，同時還通過抑制促炎性細胞因子和趨化因子分泌而產生細胞保護作用［18］。在細胞實驗中發現，LPS造成的炎癥模型中NLRP3蛋白相對表達量增加，而雷公藤紅素干預后其明顯下調，表明雷公藤紅素對炎癥反應有明顯的抑制作用。同時LPS造模后細胞PINK1、Nur77蛋白表達增加，而雷公藤紅素干預后蛋白表達減少。PINK1、Nur77蛋白是線粒體自噬過程中的兩種關鍵蛋白，在外界刺激下，在增殖、凋亡、炎癥和自噬等一系列細胞進程中發揮著重要的作用［19］，Nur77可以從細胞核里轉換至細胞核外細胞漿并定位于線粒體從而誘導細胞凋亡的現象。Nur77從核內轉運至線粒體上與腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）相互作用，在炎癥狀態下，泛素化的Nur77可以增強線粒體自噬的敏感性，形成自噬小體在溶酶體中完成線粒體自噬過程。有研究發現，雷公藤紅素抑制炎癥的過程與Nur77依賴的線粒體自噬密切相關，線粒體過度清除導致細胞缺氧可能產生細胞毒性作用［19］。通過本實驗結果推斷，雷公藤紅素在一定程度上抑制炎癥導致的線粒體自噬，減少線粒體的清除以提供足夠的能量來產生細胞保護作用，進而抑制炎癥。