流式細胞術-DNA 倍體分析在胃癌手術患者腹腔脫落腫瘤細胞檢測中的應用效果

周春華，陸斌，戴春，童瑞敏，蔣硯秋

揚中市人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 鎮(zhèn)江 212200

胃癌一般起源于胃黏膜細胞，最常見的病理類型是腺癌[1]。胃癌是多種因素共同作用的結果，在患者已有慢性炎癥、慢性萎縮性胃炎等基本病因或感染、環(huán)境等多種因素的作用下，逐漸轉變?yōu)槲赴湔T發(fā)因素主要包括感染、環(huán)境、飲食及遺傳因素等[2]。臨床中手術治療是胃癌最重要的治療方法，主要是通過胃癌根治術進行治療，但胃癌根治術后多數(shù)患者會出現(xiàn)復發(fā)轉移[3]。脫落細胞是指在自然管腔器官內(nèi)表面黏膜正常的情況下，人體器官黏膜上皮細胞發(fā)生脫落，包括自然脫落和病變脫落。臨床上主要采用腹腔沖洗細胞學（peritoneal lavage cytology，PLC）檢測人體各部位的脫落細胞，具有簡單易行、標本易獲取等優(yōu)點，但因其檢測靈敏度低而在臨床上的使用范圍較小，未獲得廣泛應用[4]。隨著醫(yī)學檢測技術的不斷發(fā)展，近年來流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）廣泛應用于臨床[5]。FCM可對上萬個細胞進行高速分析，并且能夠從單個細胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，在臨床中可用于外周白血病細胞、骨髓細胞及腫瘤細胞的檢測，其中FCM-DNA倍體分析在惡性腫瘤的診斷中逐漸被廣泛應用[6]。本研究探討了FCM-DNA倍體分析在胃癌手術患者腹腔脫落腫瘤細胞檢測中的應用效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年3月至2021年3月?lián)P中市人民醫(yī)院收治的胃癌患者。納入標準：①術前經(jīng)病理學檢查確診為胃癌；②接受胃癌根治術治療。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②依從性差；③合并腹膜、淋巴結及其他臟器轉移。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入68例患者。其中，男45例，女23例；年齡30～75歲，平均（51.27±10.34）歲；胃癌發(fā)生部位：胃上部15例，胃中部18例，胃下部31例，胃食管結合部4例；TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ期32例，Ⅳ期9例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

采集腹腔沖洗液：手術麻醉消毒后，利用電刀進行開腹探查，采用生理鹽水沖洗胃部，待生理鹽水沖洗液被吸收后，加入4%的檸檬酸鈉抗凝劑進行抗凝。

PLC檢測：將抗凝后的腹腔沖洗液離心5 min，制成薄片，對標本進行Papanicolau法染色，細胞學醫(yī)師閱片并采用高清晰度彩色病例圖文報告分析系統(tǒng)進行掃描觀察。

FCM-DNA檢測：①取腹腔積液100 ml，加入10 ml枸櫞酸鈉抗凝，待兩者充分混勻后，取20 ml，室溫下3000 r/min離心10 min，分離并去除上清液，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗2次，室溫下3000 r/min離心10 min，采用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，避光靜置10 min后采用流式細胞儀進行細胞倍體檢測；②在第1管內(nèi)加入雞紅細胞和正常淋巴細胞并將DNA熒光信號峰值作為參考值，在第2管內(nèi)加入腹腔沖洗液內(nèi)的細胞進行觀察分析，并根據(jù)指數(shù)分析做出直方圖。

1.3 觀察指標

比較PLC檢測和FCM-DNA檢測腫瘤細胞的陽性率，比較不同臨床特征胃癌患者FCM-DNA檢測的陽性率，比較不同臨床特征胃癌患者FCM檢測陽性率和PLC檢測陽性率。分析FCM-DNA和PLC檢測對胃癌術后復發(fā)的預測價值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x-±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估FCM-DNA和PLC檢測對胃癌術后復發(fā)的預測價值，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤細胞陽性檢出率的比較

24例患者經(jīng)PLC檢測出脫落腫瘤細胞，陽性率為35.29%（24/68）；46例患者經(jīng)FCM-DNA檢測出異倍體腫瘤細胞，陽性率為67.65%（46/68）。FCM-DNA檢測腫瘤細胞的陽性率高于PLC，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=14.248，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征胃癌患者FCM-DNA檢測陽性率比較

彌漫性、漿膜浸潤、腫瘤侵襲面積≥10 cm2、淋巴細胞轉移陽性、腫瘤結節(jié)陽性、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的胃癌患者FCM-DNA檢測陽性率分別高于局限性、漿膜未浸潤、腫瘤侵襲面積＜10 cm2、淋巴細胞轉移陰性、腫瘤結節(jié)陰性、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同腫瘤直徑、分化程度的胃癌患者FCM-DNA檢測陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者FCM-DNA檢測陽性情況的比較（n=68）

2.3 不同臨床特征胃癌患者FCM 檢測陽性率和PLC 檢測陽性率的比較

局限性、彌漫性、漿膜浸潤、漿膜未浸潤、腫瘤侵襲面積≥10 cm2、腫瘤侵襲面積＜10 cm2、腫瘤結節(jié)陰性、淋巴細胞轉移陽性、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者的FCM-DNA檢測陽性率均高于PLC檢測陽性率，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征胃癌患者FCM檢測陽性情況和PLC檢測陽性情況的比較

2.4 FCM-DNA和PLC 檢測對胃癌患者術后復發(fā)的預測價值

采用ROC曲線評估FCM-DNA和PLC檢測對胃癌患者術后復發(fā)的預測價值，結果顯示，F(xiàn)CMDNA預測胃癌患者術后復發(fā)的AUC為0.785，PLC預測胃癌患者術后復發(fā)的AUC為0.641。（表3）

表3 FCM-DNA和PLC檢測對胃癌患者術后復發(fā)的預測價值

3 討論

胃癌是發(fā)生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是中國常見的惡性腫瘤之一，其在中國的發(fā)病率居全部惡性腫瘤首位，好發(fā)年齡為50歲以上，男性居多，它是由多種因素共同造成的，目前幽門螺桿菌感染被認定為Ⅰ類致癌原[7]。臨床上早期胃癌患者一般無明顯癥狀，部分患者有輕微不適，可能被診斷為普通胃炎，因此不易引起重視，進展期胃癌患者可出現(xiàn)上腹部痛、體重下降等不適，晚期胃癌患者還會出現(xiàn)貧血、厭食等癥狀[8]。根治性手術是治療胃癌的主要方法，對于進展期胃癌患者，需根據(jù)病理類型及臨床分期，以手術治療為主，聯(lián)合化療、靶向治療等其他治療方法，目的主要是減輕患者痛苦，改善患者生活質量，延長患者生存期[9]。近年來，胃癌根治術后患者的遠期生活質量得到了有效提高，但進展性胃癌侵犯漿膜，導致多數(shù)患者術后復發(fā)及轉移，術后最常見的復發(fā)部位是腹腔[10]。細胞脫落主要包括自然脫落和發(fā)生病變的脫落，胃癌根治術后腹腔內(nèi)未完全清除的腫瘤細胞也會發(fā)生脫落，可成為導致胃癌術后復發(fā)的一個重要原因，腫瘤細胞脫落情況可為胃癌患者的預后評估提供依據(jù)[11]。臨床上可利用細針抽取少量病變組織并制作涂片進行脫落細胞學檢查，其特異度高，操作相對簡單，但由于靈敏度較低導致應用范圍較小[12]。隨著分子生物技術的發(fā)展，臨床中逐漸開始采用FCM對脫落腫瘤細胞進行檢測，主要是對脫落細胞進行DNA定量檢測，若發(fā)生惡性腫瘤，其致癌因素會損傷細胞DNA，可能會使DNA含量異常，從而導致正常體細胞變?yōu)槟[瘤細胞[13]。研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)異倍體細胞而難以確定為腫瘤組織，不易發(fā)現(xiàn)，但最終會發(fā)展為腫瘤，因此細胞DNA含量及倍體的定量分析對診斷惡性腫瘤具有重要意義[14]。文獻報道，在腹腔積液中采用FCM-DNA倍體分析檢測腫瘤細胞的靈敏度為61%～81%，特異度為70%～93%[15]。本研究結果顯示，24例患者經(jīng)PLC檢測出脫落腫瘤細胞，陽性率為35.29%（24/68）；46例患者經(jīng)FCM-DNA檢測出異倍體腫瘤細胞，陽性率為67.65%（46/68）。FCMDNA檢測腫瘤細胞的陽性率高于PLC（P＜0.05）。彌漫性、漿膜浸潤、腫瘤侵襲面積≥10 cm2、淋巴細胞轉移陽性、腫瘤結節(jié)陽性、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的胃癌患者FCM-DNA檢測陽性率分別高于局限性、漿膜未浸潤、腫瘤侵襲面積＜10 cm2、淋巴細胞轉移陰性、腫瘤結節(jié)陰性、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者（P＜0.05）。表明FCM-DNA檢測腫瘤細胞的陽性率會隨著浸潤深度增加、淋巴細胞轉移陽性、病理分期的升高而增加。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA定量檢測分析結果與腫瘤形成及腫瘤臨床分期具有相關性，且腫瘤呈彌漫性、腫瘤惡性程度高的患者FCM-DNA檢測陽性率較高[16]。本研究結果還顯示，局限性、彌漫性、漿膜浸潤、漿膜未浸潤、腫瘤侵襲面積≥10 cm2、腫瘤侵襲面積＜10 cm2、腫瘤結節(jié)陰性、淋巴細胞轉移陽性、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者的FCM-DNA檢測陽性率均高于PLC檢測（P＜0.05）。表明FCM-DNA檢測脫落腫瘤細胞的陽性率高于PLC檢測。ROC曲線分析結果顯示，F(xiàn)CM-DNA預測胃癌術后復發(fā)的靈敏度和特異度分別為80.23%、80.74%，而PLC預測胃癌術后復發(fā)的靈敏度和特異度分別為30.25%、80.84%，說明FCM-DNA檢測的靈敏度高于PLC檢測，前者能夠提高脫落腫瘤細胞的檢出率，降低胃癌術后復發(fā)風險。

綜上所述，采用FCM-DNA檢測腹腔脫落腫瘤細胞的陽性率高，且對胃癌術后復發(fā)具有較高的預測價值，能夠為胃癌患者的個體化治療及預后評估提供依據(jù)。