細辛水提物HPLC指紋圖譜及化學模式識別的研究*

薛子祥 ，王頌瑞，楊冬月 ，趙露露 ，歐陽慧子 ，常艷旭 ，何俊

（1.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

細辛為馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mands huricum（Maxim.）Kitag.、漢城細辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或華細辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根和根莖。前兩種習稱“遼細辛”[1]。細辛氣辛香、味溫，入肺、腎、心經。細辛在中醫藥學上具有祛風散寒、止痛、通竅、溫肺化飲等功效，臨床上常用于治療風寒頭痛、鼻塞、牙痛、痰飲咳喘、關節痛等疾病[2]。近些年來對細辛的揮發性成分研究較多[3]，但對于細辛水提物的研究相對較少[4]。Huang等[5]指出具有特異性的“馬兜鈴酸突變指紋”會被含有馬兜鈴酸的中藥誘導從而誘發肝癌。細辛為馬兜鈴科植物，其非揮發性成分中含有馬兜鈴酸[6-7]。同時，中藥材在臨床上主要采用水煎煮的提取方法，在古代臨床上早有“細辛不過錢”的說法[8]。從中藥材細辛臨床安全用藥的角度考慮，需要建立一種高效、快速的分析檢測方法完善對細辛藥材水提物的質量評價。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀（Agilent，USA）；Milli-Q IQ 7005 超 純 水 制 備 儀（Millipore公司）；5424R型高速離心機（德國Eppendorf公司）；AS 60/220.R2型十萬分之一天平（波蘭RADWAG公司）；G3KT18273型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥 對照品細辛脂素（批號：DST180425-014）、馬兜鈴酸 A（批號：DST180413-021）、芝麻脂素（批號：MUST-1706301）、卡枯醇（批號：DST190325-028）、去甲烏藥堿（批號：DST190402-154）、槲皮素（批號：DST180521-028）購于成都德思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純，購于美國Fisher公司；甲酸為色譜純，購于美國ROE公司；超純水由Milli-Q超純水儀制備。

1.3 樣品來源 10批細辛藥材分別來源于遼寧盤錦，遼寧丹東，遼寧本溪，遼寧沈陽，吉林白山，山西長治，云南本溪，遼寧錦州，吉林靖宇，遼寧新賓。經何俊研究員鑒定分別為馬兜鈴科植物北細辛、漢城細辛以及華細辛表1為不同批次細辛的來源。

表1 樣品來源

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 相為 0.1%甲酸水，B相為甲醇。梯度洗脫，洗脫梯度為：0～3 min，3%B；3～15 min，3%～50%B；15～20 min，50%～80%B。流速為 1 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL，檢測波長285 nm。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱定細辛脂素，馬兜鈴酸A，芝麻素，卡枯醇，去甲烏藥堿，槲皮素5.00mg，加入5 mL甲醇進行溶解，得到濃度為1 mg/mL的各對照品儲備液，并置于4℃冰箱冷藏備用。

2.3 供試品溶液的配制 分別稱定10個不同批次的細辛5 g，加入純水定容至50 mL，加熱回流1 h，減壓干燥得浸膏約0.45 g。精密稱定浸膏5 mg，加水1 mL溶解，渦流振蕩，14 000 r/min離心10 min，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得上清液，置于4℃冰箱冷藏備用。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度實驗 取同一批細辛供試品溶液（S1），按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，測得各個共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算RSD，結果見表2，結果表明此方法的精密度良好。

2.4.2 重復性實驗 精密稱定細辛藥材水提物（S1）6份，每份 5 g，按照“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣，測得各共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算RSD，結果見表2，結果表明此方法的重復性良好。

2.4.3 穩定性實驗 取同一批細辛供試品溶液（S1），分別在時間點 0、2、4、8、12、24 h 下按“2.1”項色譜條件進樣，測得各個共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算RSD，結果見表2，結果表明樣品放置于室溫24 h條件下穩定。

表2 細辛共有峰的精密度、穩定性、重復性結果

3 結果與分析

3.1 細辛HPLC指紋圖譜建立和相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（130723版，國家藥典委員會，2012），對10批細辛藥材水提物的實驗結果和數據進行分析，采用多點校正法建立細辛藥材水提物的指紋圖譜，指紋圖譜結果見圖1，共標定出20個共有峰，其中有6個特征峰，依次為6號峰（去甲烏藥堿），16號峰（槲皮素），17號峰（卡枯醇），18號峰（馬兜鈴酸A），19號峰（芝麻素），20號峰（細辛脂素）。混合對照品圖譜見圖2，10批細辛藥材水提物的相似度分析結果見表3。10批樣品的相似度結果均在0.908以上，初步說明3種基源的細辛藥材水提物質量相對均一穩定，推測這可能是北細辛、漢城細辛、華細辛3種基源的細辛均被藥典收錄的原因。

圖1 10批細辛藥材水提物的疊加特征圖譜

圖2 混合對照品色譜圖

表3 10批細辛藥材水提物的相似度分析結果

3.2 化學模式識別方法

3.2.1 聚類分析（HCA） 為了對指紋圖譜的結果進行補充，本研究以10批細辛指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積為變量，導入SPSS 25.0軟件，采用組間聯接法，以歐氏距離為測度進行聚類分析[9]。聚類分析結果見圖3。結果表明，當距離刻度為15時，10批細辛藥材水提物主要分為3類R1、R2、R3。R1中S6、S7、S8、S9均為北細辛，4批藥材分別來源于山西長治、云南玉溪、遼寧錦州、吉林靖宇，4批藥材的基源相同來源不同被分為了一類；R2中S4和S5均為北細辛，分別來源于遼寧沈陽和吉林白山；S1為華細辛，來源于遼寧盤錦；S10為漢城細辛，來源于遼寧新賓，4批藥材中S4和S5與S1、S10的基源不同均來源于東北三省；R3中S2為北細辛，來源于遼寧丹東；S3為漢城細辛，來源于遼寧本溪。2批藥材的基源不同均來源于遼寧省。10批細辛藥材水提物的聚類結果表明不同產地及基源的細辛藥材水提物間存在一定的質量差異。此外，聚類結果并不是按照藥材的基源或者是藥材的產地某單一變量作為劃分，該結果為今后細辛藥材水提物的質量研究提供參考。

圖3 10批細辛藥材水提物聚類分析圖

3.2.2 偏最小二乘判別分析（PLS-DA） 為了印證HCA的結果，本研究以指紋圖譜中20個共有峰的峰面積為變量，構建20×10的原始數據矩陣，使用SIMCA14.1統計軟件對10批細辛藥材水提物進行無監督模式的PLS-DA，Par作為標度化方式，繪制出PLS-DA 3D分析圖，見圖4。由圖4可知R1、R2、R3分別聚集在不同的區域，其分類結果與HCA結果一致，印證了HCA的結果。說明不同產地及基源的細辛藥材水提物間存在一定的質量差異。

圖4 10批細辛藥材水提物PLS-DA 3D圖

3.2.3 正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA） 為了進一步印證PLS-DA的結果，本研究以指紋圖譜中20個共有峰的峰面積為變量，構建20×10的原始數據矩陣，使用SIMCA14.1統計軟件對10批細辛藥材水提物進行具有監督模式的OPLS-DA，見圖5。由模型分析驗證參數可知，結實率參數R2X為0.807，區分參數R2Y為0.919，預測參數Q2為0.885，以上數據均大于0.5且原始數據矩陣中沒有異常值，表明該模型穩定并且具有較好的預測準確性[10-13]。由圖5可知R1、R2、R3分別聚集在不同的區域，其分類結果與PLS-DA的結果一致，印證了PLS-DA的結果。進一步說明了不同產地及基源的細辛藥材水提物間存在一定的質量差異。

圖5 10批細辛藥材水提物的OPLS-DA散點圖

3.2.4 主成分分析（PCA） 為進一步評價不同基源和產地的細辛藥材水提物的質量，本研究以10批細辛指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積為變量，導入SPSS 25.0軟件對10批細辛藥材水提物進行PCA。結果將20個變量降維成5個主要成分，其方差累積貢獻率為95.417%，綜合了10批細辛藥材水提物20個共有峰的大部分信息，相關矩陣的特征系數及方差貢獻率見表4。主成分綜合得分和排序見表5。結果對HCA、PLS-DA以及OPLS-DA的結果進行了補充。PCA結果表明10批細辛藥材水提物中，S4得分最高，可初步認為來源于本溪的漢城細辛在10批細辛藥材水提物中的質量相對較好，該結果為今后細辛藥材水提物的質量研究提供參考。

表4 特征系數及方差貢獻率

表5 主成分綜合得分和排序

得到的5個主成分的得分計算公式和綜合得分計算公式如下

4 討論

實驗分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水流動相體系對色譜峰的影響，發現甲醇-0.1%甲酸水為流動相時，色譜峰峰形及分離效果較好。故選擇甲醇-0.1%甲酸水作為流動相體系；對樣品溶液進行254nm，285nm，320nm檢測波長進行考察，結果發現當檢測波長為285 nm時基線相對平穩，所有色譜峰響應相對較大，故選擇285 nm作為檢測波長。

中藥指紋圖譜技術是一種能夠用于鑒別中藥真偽、區分基源、評價優劣以及保證其穩定性和一致性的高效快速的分析檢測方法[14]。但由于中藥本身化學成分復雜，再加上產地不同、基源不同等影響因素，僅使用相似度評價系統并不能全面的、多層次的對中藥材進行質量評價，需要結合其他分析方法對結果進行分析[15-16]。

化學模式識別是使用統計學或數學方法將化學體系的測量值與體系的整體建立聯系，廣泛應用于中藥材的鑒定、表征、質量評價及質量控制等研究中[17]。化學模式識別分為無監督的模式識別和有監督的模式識別，在使用化學模式識別分析數據時，單獨使用一種模式識別往往缺少科學性和代表性，因此常將兩種模式結合起來相互驗證、相互補充[18]。本實驗采HPLC法建立細辛藥材水提物的指紋圖譜，并將HCA、PLS-DA、OPLS-DA和PCA聯合使用，對所得指紋圖譜進行綜合分析，將多種分析方法聯合使用使得分析結果較大程度地避免了人為因素所帶來的誤差[19]。幾種分析結果相互驗證相互補充，使得分析結果更加可靠[20]。本實驗初步評價了不同基源和產地的細辛藥材水提物的質量。這些結果較好地闡明了細辛水提物內在的質量特征，并進一步完善了對于細辛藥材的質量評價。