女貞子中5種環(huán)烯醚萜苷類成分的降解動力學(xué)研究*

劉媚琪 ，邱紫瑩，王冬萍 ，任曉亮 ，王萌 ，孫立麗

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

女貞子為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果實，味甘、苦，性涼，主要含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、黃酮類、蒽醌類、多糖類以及揮發(fā)油等化學(xué)成分[1-2]，現(xiàn)代藥理研究表明女貞子或其提取物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗骨質(zhì)疏松以及降糖、降脂等藥理作用[3-5]。其用藥歷史悠久，是常見的補(bǔ)氣疏肝、滋陰補(bǔ)腎中藥。女貞子是出自《扶壽精方》的經(jīng)典名方二至丸中的藥材之一[6]，用于治療或緩解視力模糊、須發(fā)早白、大便郁結(jié)、骨質(zhì)疏松、腰膝酸軟等癥狀[7-10]。含有女貞子的中成藥很多，臨床上應(yīng)用廣泛，且涵蓋多種劑型，如片劑、丸劑、顆粒劑等[11]，由于其緩解防治的用藥特點以及滋養(yǎng)肝腎、益精補(bǔ)虛的藥用功效，患者可能需要很長一段時間服用該藥，而患者長時間存放或者攜帶過程中很可能受環(huán)境因素影響而使其有效成分發(fā)生降解甚至影響藥效。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)含有女貞子的成方制劑二至丸中部分藥效成分容易受到物理或化學(xué)環(huán)境的影響而發(fā)生降解[12]。環(huán)烯醚萜苷類成分是女貞子的主要活性成分之一，具有多種藥理活性，但由于其中含有酯鍵和糖苷鍵等結(jié)構(gòu)，性質(zhì)并不穩(wěn)定，易于發(fā)生水解，這是否會影響女貞子的質(zhì)量及藥效尚不可知，而且此類成分在女貞子中含量較高，但是目前對此類成分穩(wěn)定性的研究尚未見報道。

本研究采用化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)方法系統(tǒng)研究了女貞子中5種環(huán)烯醚萜苷類成分在多種物理、化學(xué)環(huán)境下的降解規(guī)律，預(yù)期為女貞子藥材以及含女貞子的藥物制劑的儲存、應(yīng)用及開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗儀器 Acquity H-class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；DELTA 320 pH儀（瑞士Mettler Toledo公司）；X224ZH十萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）；AHH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州金壇良友儀器有限公司）。

1.2 藥品和試劑 橄欖苦苷對照品（純度＞98%，批號CHB180620，成都克洛瑪生物科技有限公司）；木樨欖苷-11-甲酯對照品（純度＞98%，批號YL2012121，上海一林生物科技有限公司）；女貞酸對照品（純度＞98%，批號YL2014062102，上海一林生物科技有限公司）；女貞苷G13對照品（純度＞98%，批號YL2014062501，上海一林生物科技有限公司）；特女貞苷對照品（純度97.3%，批號111926，中國食品藥品檢定研究院）；甲酸（色譜純，美國ROE SCIENTIFICINC）；乙腈、甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；鹽酸（分析純，天津化學(xué)試劑一廠）；3% H2O2（分析純，河北吉捷生物科技有限公司）；氫氧化鈉、氯化鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氯化鐵、氯化亞鐵（分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液制備 精密稱取橄欖苦苷、女貞酸、女貞苷G13、特女貞苷和木樨欖苷-11-甲酯對照品各5.00 mg，用無水甲醇定容于5 mL棕色量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的對照品儲備液，避光放于4℃冰箱保存。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18分析柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相 A：0.1%甲酸水，流動相 B：乙腈；梯度洗脫（0～5 min，5%～15%B；5～15 min，15%～17%B；15～30 min，17%～34%B）；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

2.3 溫度對穩(wěn)定性的影響

2.3.1 溫度穩(wěn)定性實驗 分別量取“2.1”項下實驗方法配制的5種環(huán)烯醚萜苷成分樣品溶液200 μL并分別置于10 mL棕色量瓶中，用純水定容至刻度后，并置于不同溫度（37、60、80℃）環(huán)境下，得到不同溫度條件下的樣品溶液，分別進(jìn)行超高液相色譜（UPLC）分析樣品溶液中對照品的初始濃度（C0）和不同時間的剩余濃度（Ct），結(jié)果根據(jù)動力學(xué)規(guī)律，以百分剩余濃度的對數(shù)[ln（Ct/C0）]對時間（t）進(jìn)行線性擬合，繪制降解動力學(xué)曲線，計算5種活性成分在不同溫度下的降解速率常數(shù)k，并根據(jù)Arrhenius公式，以lnk對-1/T作圖（圖2），計算各成分的降解活化能Ea（公式1）。計算得到的5種環(huán)烯醚萜苷類活性成分在不同溫度下的降解速率方程、擬合系數(shù)、半衰期t0.5等相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 女貞子中5種環(huán)烯醚萜苷類成分在不同溫度下降解參數(shù)

其中k為反應(yīng)速率常數(shù)，A為指數(shù)前因子，Ea為活化能（J/mol），R為摩爾氣體常數(shù)（8.314 J/K/mol），T 為熱力學(xué)溫度（K）。

2.3.2 溫度穩(wěn)定性結(jié)果 表1結(jié)果顯示5種單體降解規(guī)律均符合一級動力學(xué)過程，5種成分在25℃下的活化能均大于40 kJ/mol，表明5種環(huán)烯醚萜苷類成分在常溫下不易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；且5種單體隨著溫度上升其降解速率常數(shù)k隨之增大，說明5種單體隨溫度升高其降解速率均明顯加快，可見各單體成分降解速率均受溫度影響，降解速率隨溫度升高明顯加大；由降解動力學(xué)曲線（圖1）可以更直觀地看出各單體隨溫度升高降解速率均明顯加快。

圖1 各單體成分在不同溫度下降解動力學(xué)曲線

2.4 pH對穩(wěn)定性影響

2.4.1 pH穩(wěn)定性實驗 分別量取“2.1”項下實驗方法配制的5種環(huán)烯醚萜苷成分樣品溶液200 μL于10 mL棕色量瓶中，并用配好的不同pH（3.0、5.0、6.2、8.0）溶液定容，得到不同pH條件下的樣品溶液，分別進(jìn)行UPLC分析樣品溶液中對照品的初始濃度（C0）和不同時間的剩余濃度（Ct），結(jié)果根據(jù)動力學(xué)規(guī)律，以[ln（Ct/C0）]對時間（t）進(jìn)行線性擬合，并分別繪制降解動力學(xué)曲線，如圖3所示，計算得到的5種環(huán)烯醚萜苷類活性成分在不同pH下的降解速率方程、擬合系數(shù)、半衰期t0.5等相關(guān)參數(shù)見表2。

表2 女貞子中5種環(huán)烯醚萜苷類成分在不同pH下降解參數(shù)

2.4.2 pH穩(wěn)定性結(jié)果 由降解動力學(xué)曲線可看出，橄欖苦苷、木樨欖苷-11-甲酯、女貞苷G13、特女貞苷在強(qiáng)酸性和堿性的環(huán)境下均不如弱酸性或接近于中性條件下穩(wěn)定，橄欖苦苷、女貞苷G13和特女貞苷半衰期在pH為5.0時最大，木樨欖苷-11-甲酯在pH為6.2時半衰期最長，最穩(wěn)定；而女貞酸在酸性條件下穩(wěn)定，隨pH增大其降解速率加快，其半衰期隨pH增大而減小。

圖2 各單體成分降解速率（lnk）與溫度（1/T）關(guān)系圖

圖3 各單體成分在不同pH下降解動力學(xué)曲線

2.5 光照對穩(wěn)定性的影響

2.5.1 光照穩(wěn)定性實驗 精密量取“2.1”項下實驗方法配制的5種環(huán)烯醚萜苷成分樣品溶液200 μL分別置于10 mL棕色量瓶中，用純水定容至刻度后，并將其分別置于黑暗避光、紫外燈（8.16×105lux）及日光燈（1.55×106lux）環(huán)境下，得到不同光照條件下的樣品溶液，分別進(jìn)行UPLC分析，分析結(jié)果根據(jù)動力學(xué)規(guī)律，以[ln（Ct/C0）]對時間（t）進(jìn)行線性擬合，并繪制降解動力學(xué)曲線，如圖4所示，并計算得到的5種環(huán)烯醚萜苷類活性成分在不同光照下的降解速率方程、擬合系數(shù)、半衰期t0.5等相關(guān)參數(shù)見表3。

表3 各單體成分在不同光照條件下的降解參數(shù)

2.5.2 光照穩(wěn)定性結(jié)果 由圖4以及表3可以看出與避光黑暗相比，5種成分在日光燈和紫外燈照射下半衰期均縮短，說明紫外燈和日光燈均會不同程度的加速5種單體成分的降解，其中紫外燈對橄欖苦苷、女貞苷G13和特女貞苷的降解影響強(qiáng)于日光燈；而女貞酸和木樨欖苷-11-甲酯則對日光燈更為敏感，降解更為明顯。

圖4 各單體成分在不同光照環(huán)境中降解曲線

2.6 金屬離子對穩(wěn)定性影響

2.6.1 金屬離子穩(wěn)定性實驗 分別取“2.1”項下實驗方法配制5種環(huán)烯醚萜苷成分樣品溶液取200 μL分別置于10 mL棕色量瓶中，分別用超純水、0.10 mol/L Fe3+、Fe2+和 Na+的水溶液定容，得到不同離子環(huán)境下的樣品溶液，分別進(jìn)行UPLC分析，以[ln（Ct/C0）]對時間（t）進(jìn)行線性擬合，并分別繪制降解動力學(xué)曲線，如圖5所示，并計算得到的5種環(huán)烯醚萜苷類活性成分在不同金屬離子下的降解速率方程、擬合系數(shù)、半衰期t0.5等相關(guān)參數(shù)見表4。

圖5 各單體成分在不同金屬離子環(huán)境中降解曲線

2.6.2 金屬離子穩(wěn)定性結(jié)果 由圖5以及表4可看出，5種成分在金屬離子環(huán)境中均會加快其降解，與水溶液相比，金屬離子環(huán)境下其半衰期明顯縮短，3種金屬離子對5種成分降解速率的影響程度均為 Fe3+＞Fe2+＞Na+。在 Fe3+環(huán)境下各成分降解速率變化明顯，各化合物降解半衰期均小于5 min，對5種化合物的穩(wěn)定性影響顯著。

表4 各單體在不同金屬離子環(huán)境下的降解參數(shù)

3 結(jié)論與討論

環(huán)烯醚萜是萜類化合物中的單萜類成分，為蟻臭二醛的縮醛衍生物，其半縮醛結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易水解或在酸性介質(zhì)中發(fā)生重排。實驗結(jié)果表明，5種環(huán)烯醚萜苷類成分中穩(wěn)定性受堿性條件影響較酸性條件更為明顯，特女貞苷、女貞苷G13、木樨欖苷-11-甲酯、橄欖苦苷均在中性條件下最穩(wěn)定，堿性和酸性條件下有不同程度的降解；猜測女貞酸可能因其含有羧基的結(jié)構(gòu)與其顯酸性的特質(zhì)，其在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下極易降解，隨pH增高降解速率加快；5種環(huán)烯醚萜苷類成分降解速率均不具備高溫穩(wěn)定性，對溫度敏感，其降解速率均隨溫度升高而加快；與黑暗避光相比，紫外燈和日光燈長時間照射均會不同程度地加速5種環(huán)烯醚萜苷類成分的降解，其中橄欖苦苷在日光燈和紫外燈下降解均較快，猜測是其結(jié)構(gòu)含有易斷裂的酯鍵和醚鍵吸收特定波長的光后發(fā)生斷裂所致；金屬離子對5種成分穩(wěn)定性也均有影響，對5種成分降解速率影響程度 Fe3+＞Fe2+＞Na+。

本研究采用化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)方法系統(tǒng)研究了女貞子中5種環(huán)烯醚萜苷類成分在多種物理、化學(xué)環(huán)境下的降解規(guī)律，提示了此類藥材或制劑應(yīng)在低溫、pH近中性環(huán)境儲存，且應(yīng)避免用鐵器儲存，避免紫外燈和日光燈長時間照射，并控制溶劑中存在的金屬離子。本研究為女貞子中環(huán)烯醚萜苷類成分在體內(nèi)的穩(wěn)定性、藥代動力學(xué)和相關(guān)制劑研究提供了一定的實驗依據(jù)，但其降解是否會對女貞子以及成方制劑藥效產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步研究。